МИКРОБИОТА КОЖНЫХ ПОКРОВОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ГЕРМЕТИЧНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ И ДЛИТЕЛЬНЫХ КОСМИЧЕСКИХ ПОЛЕТОВ ПРИ ДЕТЕКТИРОВАНИИ МЕТОДОМ ХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ МИКРОБНЫХ МАРКЕРОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность работы.
Одной из основных проблем медико-биологического обеспечения длительных пилотируемых космических полетов является предотвращение возможности развития инфекционных заболеваний у членов экипажей (Лебединский А.В. с соавт., 1964; Левашов В.В., Финогенов А.М., 1967; Нефедов Ю.Г. с соавт., 1979; Ташпулатов Р.Ю. с соавт.1979; Залогуев С.Н. с соавт.,1986; Поликарпов Н.А., 1991; Пирсон Д.Л., 1994; Горшков В.П., 1995; Лизько Н.Н., 1996; Викторов А.Н. c соавт., 1998; Новикова Н.Д., 2003; Ильин В.К., 2004, 2008; Lechtman M.D. et al., 1967; Berry Ch.A. 1970; Ferguson J.K. et al.,1973; Rodgers E., 1986; Taylor G.R., 1997; Costello E.K. et al., 2009). Известно, что кожные покровы являются мощным источником загрязнения воздушной среды герметичных помещений ограниченного объема. Количество микроорганизмов, поступающих с покровных тканей человека в окружающую среду герметично замкнутого помещения, увеличивается практически в три раза (Берлин А.А., 1990). При этом эпидемиологическое значение имеют условно-патогенные представители аутомикрофлоры кожных покровов человека, проявление патогенных свойств которых в герметично замкнутом помещении существенно возрастает (Нефедов Ю.Г., 1979; Викторов А.Н. c соавт. 1986,1998; Залогуев С.Н. с соавт.,1986; Новикова Н.Д., 2003).
Изменения функционального состояния кожи у космонавтов развиваются в результате нарушения колонизационной резистентности организма, как результат воздействия неблагоприятных условий среды обитания: ограниченного объема помещения, перекрестной аутоинфекции, многокомпонентного загрязнения воздуха химическими веществами, астении, стрессовых ситуаций, которые в сочетании со снижением иммунологической реактивности организма и нарушением барьерной функции эпителия, способствуют активизации потенциально патогенной микрофлоры у космонавтов (Залогуев С.Н. с соав. 1980; Поликарпов Н.А., 1991; Ильин В.К. с соавт. 2004).
Следует отметить, что в условиях эксплуатации Международной космической станции при частой сменяемости членов экипажей из различных географических регионов возрастает опасность развития оппортунистических инфекций у человека, обусловленных активацией условно-патогенной микрофлоры (Дроздова В.П. с соавт., 1970; Прохоров В.Я., 1971; Старцева Н.Д., 1976; Борисова О.К., 1976; Залогуев С.Н. c соавт.,1986; Новикова Н.Д., 2001; Mishra S.K., Pierson D.L.,1992; Taylor G.R., 1993; Пирсон Д.Л. c соавт., 1997).
Однако проблемой остается невозможность оценки роли некоторых групп микроорганизмов, труднокультивируемых с помощью классического бактериологического метода, прежде всего анаэробов. Используемые в последнее десятилетие молекулярно-биологические методы видоспецифичны,  но могут дать ложноположительные результаты и значительно варьируют, затрудняя оценку общей численности популяции, (Нобл У.К., 1986; Осипов Г.А. и др. 1996, 2003; Noble W.C., 1993; Dekio I. et. al., 2005).
Перспективным является метод газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС) (дайте ссылку, если не поздно на Осипов Г.А. и др. 1996), основанный на идентификации и  количественном определении специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов в биопробе (Васюренко З.П., 1992; Goodfellow M., Minnikin D.E., 1985; Grice E.A. et al., 2009).
Хемодифференциация микроорганизмов методом газовой хроматографии – масс спектрометрии по видоспецифичным, генетически детерминированным высшим жирным кислотам, альдегидам и стеаринам (стеринам) клеточной стенки позволяет детектировать микроорганизмы на уровне семейства, рода и вида с количественной оценкой ауто- и инородной микробиоты человека (Албертс Б., 1994; Турова Е.С., 1996; Осипов Г.А., 2005, 2007).
Высокочувствительный, селективный метод газовой хроматографии – масс спектрометрии c установлением микробных маркеров, применительно к специфичным условиям обитания человека в герметичных помещениях и длительных космических полетах, позволит оперативно проводить мониторинг микробиологического статуса человека (длительность ГХ-МС анализа составляет  3 часа) и разработать адекватные методы профилактики для снижения риска возникновения инфекционных заболеваний.
В связи с этим научный и практический интерес представляют исследования, позволяющие расширить спектр родового и видового составов микробных сообществ, формируемых на кожных покровах человека при длительной изоляции в герметичных помещениях и космических полетах, с внедрением оперативного метода контроля и диагностики микробиоценоза кожи человека в реальном времени по молекулярным маркерам.
Цель работы. Исследование микробиоты кожных покровов человека при длительной изоляции  в герметичных помещениях и в космических полетах методом масс-спектрометрии микробных маркеров и установление возможности применения метода ГХ-МС для оперативной диагностики анаэробной и условно патогенной микрофлоры человека в длительных космических полетах.
Задачи исследования:

1. Разработать технологию отбора, хранения и тестирования кожных проб для проведения хромато-масс детектирования.
2. Экспериментально сравнить родо/видовой составы микробиоты кожных покровов здорового человека при длительности изоляции от 105 и до 390 суток в герметичном помещении и в условиях космическом полета (до 180 суток).
3. Провести сравнительный анализ микробного статуса кожных покровов человека культуральным методом и методом ГХ-МС детектирования.
4. Установить реперные точки для анализа микробной обсемененности кожных покровов человека, достаточных для объективной и оперативной оценки микробного статуса.
5. Методом кластерного анализа установить маркеры — диагностически значимые микроорганизмы собственной и инородной микробиоты, определяющие микробиологический статус человека при изоляции в герметичном объекте и в космическом полете.

Научная новизна работы.
Впервые детектированием методом ГХ-МС при длительной изоляции в гермообъеме и космическом полете расширен видовой/родовой диапазон комменсальной и условно-патогенной аутомикрофлоры кожных покровов человека, трудно культивируемой классическим бактериологическим методом, включая анаэробную микрофлору глубоких слоев кожи и: Eubacterium lentum, Bacillus cereus, Nocardia sp., Pseudonocardia, Actinomycetes, Pseudonocardia, Rhodococcus, Alcaligenes, Prevotella, Propionibacterium sp., Propionibacterium acnes, Clostridium sp., Fusobacterium, Malassesia, Peptostreptococcus anaerobius.
Микробиота кожных покровов человека делится на две группы- микроорганизмы, которые претерпели количественные изменения в результате условий изоляции в гермобъеме (Actinomуcetes, Rodococcus, Propionobacterium acnes, Streptococcus sp., Candida, Peptostreptococcus anaerobius, Bacillus cereus), среди которых преобладали представители условно-патогенной аутомикрофлоры, включая потенциальных возбудителей оппортунистических инфекций, и — микроорганизмы, количественно не отреагировавшие на  экстремальные условия длительной изоляции в гермообъекте (Staphylococcus sp., Enterococcus, Nocardia, Pseudomonas aeruginosa, Propionobacterium sp., Acinetobacter, Fusobacterium, Lactobacillus sp., Alcaligenas, Prevotella, Malassezia, Eubacterium lentum , Clostridium sp.)
Показано, что дисбиотические изменения кожных покровов человека при длительной (390 суток) изоляции в герметичных помещениях характеризуются определенной закономерностью и имеют волнообразный характер с периодами активации условно-патогенной аутомикрофлоры в первый месяц адаптации человека к условиям изоляции и периодом относительной стабилизации видового и количественного состава микробиоты. Второй период активации условно-патогенной микрофлоры наблюдается с 270 суток изоляции и достигает максимальных значений по мере увеличения длительности изоляции человека до года. Из числа микроорганизмов, количественно прореагировавших на условия длительной изоляции, группу риска составили: Streptococcus sp., — потенциальные возбудители стрептодермий, в частности импетиго и рожистого воспаления кожи, P. acnes – являющиеся главным звеном в патогенезе угревой болезни, и Actinomycetes — потенциальные возбудители актиномикоза.
Практическая значимость работы.
Внедрение метода оперативного  контроля по молекулярным маркерам методом  ГХ-МС детектирования позволит проводить мониторинг условно-патогенной и анаэробной микробиоты кожных покровов и снизить риск возникновения инфекционных заболеваний при длительной изоляции человека в герметичном помещении и в условиях космического полета.
Установление микробных маркеров микробиологического статуса человека создает основу для оперативного контроля и разработки бортовой аналитической аппаратуры в реальных условиях полета.
Разработана и апробирована технология отбора и подготовки кожных проб для анализа методом ГХ-МС в течение длительного космического полета и применительно к условиям герметичных помещений.
Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод ГХ-МС, являясь высокочувствительным, некультуральным методом детектирования микробиоты кожных покровов человека по видоспецифичным высшим жирным кислотам клеточной стенки микроорганизмов, позволяет расширить видовой/родовой диапазон идентификации комменсальной и условно-патогенной аутомикрофлоры, включая микроорганизмы, трудно культивируемые классическими бактериологическими методами: Pseudonocardia, Actinomycеtes sp., Rhodococcus, Nocardia sp., Pseudonocardia, Propionibacterium sp., Peptostreptococcus anaerobius, Fusobacterium, Alcaligenas, Prevotella, Malassezia, Bacillus cereus, Eubacterium lentum, Clostridium sp. и др.
2. Хемодифференциацией микроорганизмов методом ГХ-МС детектирования с установлением молекулярных маркеров показано, что в при длительной изоляции в гермобъеме и в космическом полете микробиота кожи человека характеризуется количественными и видовыми изменениями, с увеличением доли условно-патогенных микроорганизмов (включая анаэробные), что является одним из факторов микробиологического риска и определяет необходимость осуществления оперативного мониторинга состояния микрофлоры кожных покровов по микробным маркерам.

Апробация работы.
Основные результаты и положения диссертации докладывались и обсуждались: на Международном конгрессе «Человек и космос» (Москва, Россия, май 2009); на VIII «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной дню космонавтики (Москва, апрель 2009); на Всероссийской конференции «Экотоксикология- 2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии (Пущино — Тула, Россия, октябрь 2009); на IX «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов», посвященной дню космонавтики (Москва, апрель 2010); на «ХХХVIII Международных общественно- научных чтениях, посвященных памяти Ю. А. Гагарина» (Гагарин, Россия, март 2011); на конференции «Актуальные проблемы космической биологии и медицины» (Москва, Россия, октябрь 2011).
Диссертация прошла апробацию на заседании секции Учёного Совета ГНЦ РФ-ИМБП РАН   “Космическая медицина” (протокол №1 от 12 января 2012 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель включает 230 наименований, из них 118 российских и 112 иностранных. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
При выполнении работы проведены исследования с участием человека при длительности изоляции от 105 до 390 суток в герметичных обитаемых помещениях и космонавтов в длительных космических полетах. Группу контроля составили добровольцы в обычных условиях жизнедеятельности.
Основные направления экспериментальных исследований и их объем представлены в табл.1.
 Отбор проб.
Отбор проб микрофлоры покровных испытателей ? проводился по общепринятой в микробиологической практике методике – методом кожных смывов (Залогуев С.Н., Тейлор Г.Р., 1974). В условиях космического полета для взятия кожных проб использовали стандартные укладки со стерильным ватным тампоном, помещенным в пробирку с капилляром и консервантом, обеспечивающим сохранение исходного состава микрофлоры на срок до 5 суток. Отбор аутомикрофлоры у космонавтов — членов экипажей МКС проводился со следующих биотопов: лба, щек, шеи, груди, подмышечных впадин, паховой области, ладоней рук. В наземных экспериментах забор кожных проб производился с участков подмышечных впадин и паховой области. Отбор микрофлоры осуществлялся в одно и то же время: натощак, до принятия душа не ранее 2 часов перед шлюзованием. Площадь исследуемой поверхности кожи — 4X5 см. После этого ½ тампона, отделенного пинцетом, использовалась при ГХ-МС анализе, а другая ½ — при бактериологическом исследовании.
 
Таблица 1. Структура и объем проведенных исследований.

 
 
 
Анализ микрофлоры кожи бактериологическим методом исследования.
Микробиологические исследования у здоровых лиц производились в лаборатории микроэкологии человека Отдела санитарно — гигиенической безопасности человека в искусственной среде обитания ГНЦ РФ — ИМБП РАН.
Исследование мазков: посев, микроскопию, оценку количественным методом, оценку результатов и идентификацию выделенных культур (с использованием соответствующих сред и методов) проводили в соответствии с методикой, описанной в приказе МЗ №535 от 22.04.1985г. Биохимическая идентификация проводилась с использование коммерческих тест систем LACHEMA в соответствии с инструкцией производителя.
Анализ микрофлоры кожи методом хроматомасс-спектрометрического детектирования.
ГХ-МС анализ отобранных проб проводился в лаборатории санитарно-химической безопасности и токсикологии ГНЦ РФ- ИМБП РАН.
Анализ и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли по методике «Оценка микроэкологического статуса человека методом хроматомасс-спектрометрии», утвержденной Росздравнадзором № 2010/038 от 24.02.2010 г. с внесенными изменениями для кожных проб.
Анализ проводился непосредственно после отбора проб или пробы замораживали и хранили при — 5/ -18ºС, если  немедленный анализ был невозможен. Пробоподготовка предусматривала проведение кислого метанолиза: в виал с пробой приливали 400 мкл 1N соляной кислоты в метаноле, завинчивали плотно крышкой и термостатировали при 80⁰С в течение 1 часа. К охлажденной реакционной среде добавляли 400 мкл гексана. Смесь встряхивали на вибраторе и отстаивали до разделения фаз в течение 5 мин при комнатной температуре. Верхнюю, гексановую фракцию отбирали порциями по 80 мкл в чистый виал и высушивали 5-7 мин при 80°С. Сухой остаток обрабатывали 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80°С и закрытой крышке. К реакционной смеси добавляли микропипеткой 80 мкл гексана и переносили смесь в коническую вставку, которую помещали в тот же виал, и завинчивали его плотно крышкой. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы AT-5973 Agillent Technologies (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Хьюлетт-Паккард. Масс-спектрометр — квадрупольный, с ионизацией электронами (70эв) работал в режиме селективных ионов (SIM) при периодическом детектировании до 30 ионов в пяти интервалах времени.
Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе с использованием внутреннего стандарта – тридейтеро-метилового эфира тридекановой кислоты. Верификация данных масс-фрагментограмм состояла в измерении площадей пиков ионов определенной массы на селективной хроматограмме специфических веществ — маркеров микроорганизмов, учитывая время хроматографического удерживания. Данные автоматической обработки требовали частичной, ручной проверки измерения. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL.
 
Статистическая обработка результатов.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием кластерного анализа (Егоров А.Д c соавт., 2009; Трифонова О.П. с соавт., 2010). Достоверными считали различия при р<0,05. Статистическую обработку данных, полученных при фоновых исследованиях, выполняли с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» для Microsoft  Windows.
 
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Топическая характеристика микробной обсемененности кожных покровов и выбор реперных точек для мониторинга микробиоты кожи в условиях космического полета.
В соответствии с задачами  исследование микрофлоры кожных покровов обследованных проводилась классическим бактериологическим методом и методом хроматомасс-спектрометрического детектирования ( ГХ-МС). На коже обследованных методом ГХ-МС идентифицированы микроорганизмы, принадлежащие к 22 родам/видам. Количественно определены следующие виды микроорганизмов: Pseudonocardia, Actinomyces sp., Rhodococcus, Nocardia sp., Propionibacterium sp., Propionibacterium acnes, Corinebacterium sp., Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Lactobacillus, Enterococcus, Peptostreptococcus anaerobius, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Fusobacterium, Alcaligenas, Prevotella, Candida, Malassezia, Bacillus cereus, Eubacterium lentum (группа А), Clostridium sp.
В результате исследований установлено, что анализ кожных проб при длительной изоляции человека в гермообъеме и в космическом полете  методом ГХ-МС детектирования  позволил расширить родовой/видовой диапазон комменсальной и условно-патогенной аутомикрофлоры, труднокультивируемой классическим бактериологическим методом, включая анаэробную микрофлору глубоких слоев кожи,: Eubacterium lentum, Bacillus cereus, Nocardia sp., Actinomycetes, Pseudonocardia, Rhodococcus, Alcaligenes, Prevotella, Propionibacterium sp., Propionibacterium acnes, Clostridium sp., Fusobacterium, Malassesia, Peptostreptococcus anaerobius ( рис. 1, 3).
 


Рис. 1. Распределение микроорганизмов кожных покровов лба, шеи, щеки, руки, груди по отношению к реакции на воздействие комплекса факторов космического полета (p<0,05).




Рис. 1 (продолжение). Распределение микроорганизмов кожных покровов лба, шеи, щеки, руки, груди по отношению к реакции на воздействие комплекса факторов космического полета (p<0,05).
 
Кластерный анализ  полученных результатов позволил все идентифицированные микроорганизмы биотопов лба, щеки, шеи, груди, руки, подмышечной впадины и паховой области разделить на две группы — два кластера (рис. 2, 3). Первая — группа микроорганизмов, которая количественно отреагировала  на действие комплекса факторов космического полета — Cluster 1. Cluster 2 — группа микроорганизмов, количественно не отреагировавших на действие факторов космического полета, находившихся на относительно стабильном уровне в течение всех сроков исследования.






Рис. 2. (продолжение) Динамика общей обсемененности микроорганизмов кожных покровов биотопов лба, шеи, груди, руки, щеки космонавтов (p<0,05).
 
При длительной изоляции человека в космическом полете видовой состав микрофлоры во всех исследованных биотопах был одинаков с индивидуальной вариабельностью  количественного состава по биотопам. К Claster 1 относились Actinomycetеs, Rodococcus, P. acnes, Streptococcus sp., Candida, Pseudonocardia. Причем с наибольшей значимостью и наименьшими расхождениями количественно прореагировали Actinomycetеs, P. acnes, Streptococcus sp., являющимися условно-патогенными  для человека (p<0,05). Данные микроорганизмы значительно увеличили свою численность при посадке.
Вторая группа микроорганизмов, представленная в исследованиях — Сlaster 2. К ним относились: Staphylococcus sp., Enterococcus, Peptostreptococcus anaerobius, Nocardia, Lactobacillus, Pseudomonas aeruginosa, Propionobacterium sp., Acinetobacter, Corinebacterium sp., Fusobacterium, Alcaligenas, Prevotella, Malassezia, Eubacterium lentum (группа А), Cl. perfringens, Cl. difficile. Микроорганизмы этой группы оставались относительно стабильными по численности на протяжении всего эксперимента.
Микробная флора в области подмышечной впадины и паховой области отличалась наибольшей обсемененностью и сходной картиной по составу прореагировавших групп у всех обследованных космонавтов (рис. 3, 4).







Рис. 3. (продолжение) Основные группы микроорганизмов кожных покровов подмышечной впадины и паховой области, прореагировавшие количественно на факторы космического полета (p<0,05).

Рис. 4. Изменение общей обсемененности кожи космонавтов в условиях длительного космического полета и по его окончании (среднее, по результатам ГХ-МС).
 
Ранее исследователями отмечалось, что особенно обильно заселены микроорганизмами те области кожных покровов, которые защищены от действия света и высыхания (Noble W.C., 1993; Hopwood D. et al., 2005; Wilson M., 2008). Преимущественная микробная обсемененность подмышечной и паховой областей обусловлена значительным количеством  апокриновых и эккриновых желез, наличием грубых волос, более высоким значениям рН, по сравнению с другими исследованными биотопами, относительно постоянными показателями температуры и высокой влажностью.
При длительной изоляции человека в гермообъеме к физиологически обусловленным благоприятным для развития микроорганизмов условиям добавляются  неблагоприятные условия среды обитания: объем помещения, ограничение средств личной гигиены и объем помещения, что обусловило выбор данных биотопов для оценки микробиоценоза кожи.
В исследованиях, проведенных в выбранных биотопах установлено, что на кожных покровах космонавтов в начале полета (6-10 сутки) наблюдается увеличение численности некоторых представителей условно-патогенной микробиоты: P. acnes – ( на 11,9 % в ПВ и 9,4 % в ПО) и Candida – ( на 2,3 % в ПО), Actinomycetes ( в ПВ — на 2% , в ПО – на 2,5%) с одновременным уменьшением доли защитных групп микроорганизмов кожных покровов – Corinebacterium sp.- на 2,5% в ПВ и 1,1% в ПО (рис. 5).


Рис. 5. Изменение содержания ( % ) анаэробной и аэробной микрофлоры кожных покровов, обследованных в подмышечной впадине при изоляции в космическом полете.
Полученные результаты подтверждают литературные данные о снижении колонизационной резистентности организма в начале полета (Залогуев С. Н. с соавт., 1980; Поликарпов Н. А., 1991; Ильин В. К. с соавт, 2005). Для некоторых условно-патогенных групп микроорганизмов ( P. acnes, Streptococcus sp., Acinomycetes, Rodococcus) значимое ( p<0,05) повышение численности зафиксировано на 0 сутки приземления, с тенденцией к восстановлению состава биоценоза на 7 сутки по окончании полета.
Микробиологический статус кожных покровов здорового человека в обычных условиях жизнедеятельности и в условиях  длительной изоляции в гермобъеме при детектировании методом ГХ-МС.
Исследованы кожные покровы практически здоровых обследованных в обычных условиях жизнедеятельности и в условиях изоляции в герметично замкнутых помещений (105 и 390 суток). Результаты исследований показали однотипность количественной реакции и состава микроорганизмов кожных покровов на условия обитания в герметичном помещении и космическом полете, что позволило оценку микробиоты кожи обследованных при длительной изоляции в гермобъеме проводить по реперным точкам — подмышечной впадине (ПВ) и паховой области (ПО).
При исследовании микроорганизмов кожных покровов в обычных условиях жизнедеятельности человека с использованием метода ГХ-МС был составлен микробный пейзаж данных областей в обычных условиях жизнедеятельности (рис. 6). Был выявлен широкий спектр микроорганизмов и показано, что представители анаэробов (Peptostreptococcus anaerobius, Bacillus cereus, Clostridium sp., Propionobacterium sp., Actinomycetes) являются полноправными участниками биоценоза кожи, что подтверждается и литературными данными (Шендеров Б. А., 2003; Кабаева Т. И., 2005; Costello E. K. et al., 2009).
 

 

Рис. 6. Микробный пейзаж подмышечной впадины и паховой области человека (n=34) в обычных условиях жизнедеятельности.
 
При длительной (105 суток) изоляции обследованных в герметически замкнутых помещениях «пик» повышения контаминации условно-патогенных микроорганизмов пришелся на 35 сутки исследований в ПВ, ПО (рис. 7).


Рис. 7. Динамика численности и периоды активации условно-патогенных микроорганизмов кожных покровов человека при длительности изоляции до 105 суток ( p<0,05).
 
Исследование содержания анаэробной и аэробной микрофлоры кожных покровов, обследованных в реперных точках – ПВ и ПО выявило, что на 35 cутки эксперимента происходит значимое ( p<0,05) увеличение P. acnes, Streptococcus sp., Actinomycetes, Candida, Peptostreptococcus anaerobius, Pseudonocardia, Rodococcus и, наоборот, уменьшение Corinebacterium sp.- на 3,5% в ПВ и 1,25% в ПO. В дальнейшем (до 105 суток) наблюдался процесс стабилизации с уменьшением численности условно-патогенной микрофлоры. В первые сутки после окончания изоляции в ПВ дисбиотические изменения проявились в ПВ, тогда как в ПО наблюдалась нормализация количественного и качественного состава микроорганизмов (рис. 8).
Аналогичная динамика дисбиотических изменений кожи наблюдалась в первые сутки полета у космонавтов  и при длительной изоляции в наземных исследованиях с последующей относительной стабилизацией общей микробной обсемененности кожных покровов, что позволило считать это свидетельством дисбактериотических процессов — реакции на адаптацию к условиям изоляции в гермообъеме. Это явление было описано ранее и объясняется снижением колонизационной резистентности в первый месяц изоляции (Залогуев С.Н. с соавт., 1983; Викторов А.Н. с соавт., 1998; Поликарпов Н. А., 1991; Ильин с соавт., 2008).


Рис. 8. Динамика индивидуальных изменений активации микроорганизмов подмышечной впадины и паховой области, характеризующих микробиологический риск, и защитных групп микроорганизмов при 105 суточной изоляции (ГХ-МС детектирование, Р<0,05).
 
Сопоставимость общей динамики дисбиотических изменений кожных покровов обследованных с превалированием условно-патогенной микрофлоры по данным ГХ-МС подтверждается бактериологическим данными, в которых также показано, что при длительной изоляции человека в гермообъекте (105 суток) наблюдается увеличение доли групп, известных в качестве условно-патогенных.
Бактериологический метод выявил наличие на коже испытуемых представителей резидентной микрофлоры: S. epidermidis и S. aureus ( Рис. 9). При этом в первый месяц изоляции наблюдалось  преимущественное увеличение доли транзиторной компоненты микробиоценоза кожи:  Enterococcus sp.- на 1%- в ПВ и 38% в ПО, E. coli – на 1% в ПВ и в ПО, Proteus sp.- на 27% в ПВ и в 5 % в ПО, Streptococcus sp.- на 1%  и Candida – на 1% в ПВ на фоне увеличения общей обсемененности исследованных биотопов. С 90 суток  наступал процесс стабилизации и в конце исследований — на 14 сутки после эксперимента происходило возвращение значений к исходным данным.
При увеличении длительности изоляции до 390 суток состав микрофлоры характеризовался статистически значимым (p<0,05) повышением численности в ПВ на 30-е сутки эксперимента, в ПО — на 30-е и 90-е сутки исследования (рис. 10). По приоритетности колонизации ПО и ПВ доминирующие позиции в этот период были представлены условно-патогенной флорой: Streptococcus ( 29,8% в ПВ и 40 % в ПО), Actinomycetes ( 35,5 % ПВ и 19,2 % в ПО), Rodococcus (17,9% в ПВ и 16,7 % в ПО) , Candida (13,3% в ПВ и 9,9% в ПО) , Staphylococcus (10,6 % в ПВ и 1,1 % в ПО), P. acnes ( 8,4% в ПВ и 3,7 % в ПО). Защитные группы микроорганизмов — Corinebacterium sp., составляющие до эксперимента в  ПВ 3,68% и в ПО 3,98%, уменьшили свою долю среди других микроорганизмов, составив на 30-е сутки изоляции 0,1% и 1,49% в ПВ и ПО соответственно.
Рис. 10. Динамика численности и периоды активации условно-патогенных микроорганизмов кожных покровов человека при увеличении длительности изоляции до 390 суток ( p<0,05).
 
Период с 120–х до 240-х суток характеризовался относительной стабилизацией видового и количественного состава микробиоты с уменьшением численных значений представителей условно-патогенной флоры. Однако, начиная с 270-х суток, наблюдалось постепенное нарастание потенциала патогенности, ставшее значимым (p<0,05) к 360-м суткам (рис. 11).
В исследованиях наиболее значимо количественно прореагировали Streptococcus sp., P. acnes, Actynomicetes – что позволяет рекомендовать их как диагностически значимые микроорганизмы (маркеры), позволяющие характеризовать микробный статус человека в условиях изоляции в герметично замкнутых помещениях.
 
Рис. 11. Динамика индивидуальных изменений активации микроорганизмов подмышечной впадины и паховой области, характеризующих микробиологический риск, и защитных групп микроорганизмов при 390 суточной изоляции.
 
Таким образом, дисбиотические изменения кожных покровов при длительной (390 суток) изоляции человека в герметичных помещениях характеризуются определенной закономерностью и имеют волнообразный характер (рис. 12). Активация условно-патогенной аутомикрфлоры наблюдается в первый месяц адаптации человека к условиям изоляции. В последующие сутки (120-240) прослеживается относительная стабилизация видового и количественного состава микробиоты. Постепенное увеличение с 270 суток численности условно-патогенной микрофлоры характеризует снижение барьерной функции эпителия и колонизационной резистентности кожных покровов. Значимая (р<0,05) активация условно-патогенной микрофлоры по мере увеличения длительности изоляции до 390 суток является прогностически важной для длительных межпланетных полетов. Наибольшая значимость из числа микроорганизмов, количественно прореагировавших на условия длительной изоляции — у Streptococcus sp., потенциальных возбудителей стрептодермий, в частности импетиго и рожистого воспаления кожи, P. acnes – являющихся главным звеном в патогенезе угревой болезни, и Actinomycetes— потенциальных возбудителей актиномикоза.
 
 
Рис. 12 Закономерности формирования условно-патогенной микрофлоры кожных покровов человека при длительной изоляции в гермообъектах и в космическом полете.
 
Аналогичная динамика дисбиотических изменения микробиоценоза кожных покровов наблюдалась и у космонавтов и характеризовалась дисбиотическими проявлениями на этапе острой адаптации к среде обитания космических кораблей. Увеличение численности условно-патогенной микрофлоры космонавтов после приземления (0 сутки) обусловлено, по-видимому, снижением иммунобиологической реактивности в длительном полете и стрессовой реакцией организма на экстремальные условия приземления.
Таким образом, исследованиями методом ГХ-МС был значительно расширен спектр исследуемой микрофлоры кожи человека и установлена закономерность формирования условно–патогенной микробиоты кожных покровов человека при длительной изоляции в геметичных помещениях по молекулярным маркерам. Метод ГХ-МС, являясь высокочувствительным, некультуральным методом детектирования микробиоты кожных покровов человека по видоспецифичным высшим жирным кислотам, альдегидам, стеаринам (стеринам) и экспрессным по времени анализа (не более 3 часов), представлется перспективным и может  служить дополнением к бактериологическому методу, а также быть использованным на борту МКС.
 
Выводы:

1. При длительной изоляции человека в гермобъекте и в условиях космического полета видовой состав микрофлоры во всех исследованных биотопах был одинаков при индивидуальной вариабельности количественного состава по биотопам. Важными составляющими микробиоценоза кожных покровов человека являются анаэробные бактерии, включая Propionobacterium sp., Actinomycetes, Rodococcus, Nocardia, Pseudonocardia, Clostridium sp.
2. Метод ГХ-МС является высокочувствительным, видоспецифичным по высшим жирным кислотам клеточной стенки микроорганизмов, некультуральным методом анализа микрофлоры кожи человека и позволяет расширить видовой/родовой диапазон диагностики комменсальной и условно-патогенной аутомикрофлоры кожных покровов человека, включая микробиоту более глубоких слоев эпидермиса, труднокультивируемую классическим бактериологическим методом.
3. Метод масс-спектрометрии микробных маркеров является перспективным для диагностирования условно-патогенной и анаэробной микрофлоры кожных покровов человека в эпидемиологически значимых концентрациях, составляющих микробиологический риск при длительной изоляции человека в герметичном помещении.
4. Дисбиотические изменения кожных покровов при длительной изоляции человека в герметичных помещениях характеризуются определенной закономерностью и имеют волнообразный характер. Активация условно-патогенной аутомикрфлоры наблюдается в первый месяц адаптации человека к условиям изоляции. Относительная стабилизация видового и количественного состава микрофлоры наблюдалась до 270 суток с повторной активацией (p<0.05) на 360-390 сутки, обусловленной снижением колонизационной резистентности кожных покровов и в первые сутки по окончанию воздействия неблагоприятных условий обитания.
5. Микрофлора кожных покровов космонавтов при длительности полета 180 суток характеризуется дисбактериотическими изменениями во всех исследованных биотопах на этапе острой адаптации к среде и 0 сутках после приземления и проявляется увеличением численности условно-патогенной микрофлоры с тенденцией к возвращению микробиологического статуса в исходное состояние на 7 сутки после приземления.
6. На основании данных ГХ-МС микробиоту кожных покровов человека в условиях изоляции в герметичном помещении и космическом полете можно разделить на два кластера.  Кластер 1 — микрофлора, которая претерпевала количественные изменения, важной составляющей которой были условно-патогенные микроорганизмы: Actinomycetes, Rodococcus, Propionobacterium acnes, Streptococcus sp., Candida , Peptostreptococcus anaerobius, Bacillus cereus.

Кластер 2 – составляют  микроорганизмы, которые  количественно  не прореагировали на экстремальные условия изоляциии и были в основном представлены комменсальной микрофлорой.

7. Сравнительным анализом микрофлоры кожных покровов человека с использованием классического бактериологического метода и ГХ-МС детектирования установлены диагностически значимые микроорганизмы (маркеры), позволяющие характеризовать микробный статус человека в условиях космического полета: Propionibacterium acnes, Streptococcus sp. и Actinomycetes.
8. Анализом микрофлоры кожных покровов человека ГХ-МС методом показана возможность реперного подхода для оценки микробиологического статуса человека по микробной обсемененности подмышечной впадины и паховой области, что позволит оперативно диагносцировать микробиологический статус космонавтов.

 
Практические рекомендации.
Результаты исследований видового состава и количественной характеристики микробиоты кожных покровов человека предполагается использовать при организации медицинского обеспечения длительных космических полетов и в практическом здравоохранении.
 
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Оценка влияния 105-суточной изоляции в герметично замкнутом пространстве на микрофлору кожных покровов человека с использованием метода хроматомасс- спектрометрии / Марданов Р.Г., Родионова Т.А., Батов А.Б., Осипов Г.А. / Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2010. — Т. 44. — №4. — С. 46-52.
2. Микрофлора человека в условиях применения аутопробиотиков на основе Enterococcus feacium при 105-суточной изоляции. / Ильин В.К., Батов А.Б., Новикова Н.Д., Мухамедиева Л.Н., Поддубко С.В., , Марданов Р.Г., Соловьева З.О., Скедина М.А. / Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2010. — Т. 44. — №4. — С. 52-57.
3. Оперативная диагностика микробиологического статуса кожных покровов человека методом хроматомасс-спектрометрического детектирования / Авиакосмическая и экологическая медицина. -2011. — Т. 45. — №3. — С. 12-17.
4. Исследование влияния изоляции в герметично замкнутом пространстве на микрофлору кожных покровов человека с использованием метода хроматомасс-спектрометрии / Родионова Т. А. / Сборник материалов по коференции «Экотоксикология. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». — Пущино – Тула. – 2009. – С. 26-28 .
5. Non-cultural methods of human microflora evaluation for the benefit of crew medical control in confined habitat / Ilyin V., Moukhamedieva L., Osipov G., Batov A., Soloviova Z., Mardanov R., PaninaY. / Acta Astronautica. – 2011. — V. 68. – P. 1529–1536.
6. Диагностика микроэкологического статуса человека методом хроматомасс-спектрометрического ( ГХ-МС) детектирования клеточных маркеров / Мухамедиева Л. Н., Осипов Г.А., Ильин В.К., Пахомова А.А. / Материалы научно-практической конференции сотрудников Таджикского НИИ Профилактической медицины «Современные аспекты краевой инфекционной патологии в Таджикистане». – Душанбе. — 2010. — C. 61-64.
7. Исследование микрофлоры кожных покровов космонавтов методом хроматомасс- спектрометрического детектирования / Батов А.Б. / Сб. тезисов VIII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики. – Москва. -2009. — C. 15-16.
8. Экспресс- диагностика микрофлоры кожных покровов здорового человека в эксперименте « Марс- 105» методом ГХМС детектирования / Батов А.Б. / Сб. тезисов IX Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики. – Москва. – 2010. — C. 29.
9. Исследование микрофлоры кожи участников МКС методом хроматомасс-спектрометрического детектирования / Ильин. В.К., Осипов Г.А. / Cб. тезисов XXXVIII Общественно-научных чтений, посвящённых памяти Ю.А. Гагарина. — Гагарин. – 2011. – С. 215-225.
10. Топическая характеристика микробной обсемененности кожных покровов для выбора реперных точек оценки микробиологического статуса человека в условиях герметичных помещений / Сб. тезисов конференции «Актуальные проблемы космической биологии и медицины». – Москва. 2011. – 151-152.
11. Контроль микробиологического статуса космонавтов в длительном космическом полете: настоящее и перспективы / Ильин В.К., Соловьёва З.О., Скедина М.А., Папп Л.Г. / Сб. тезисов конференции «Актуальные проблемы космической биологии и медицины». — Москва. – 2011.- С. 165-166.