- Корзина пуста.
Верификация метода
В пользу микробного происхождения жирных кислот, альдегидов и стеринов, не характерных для клеток организма человека, свидетельствуют следующие соображения и факты.
Хорошо известно, что в клетках млекопитающих отсутствуют гидрокси, циклопропановые и ненасыщенные ЖК
В результате проведенных нами анализов (несколько тысяч) биологических жидкостей человека и животных было определено, что динамичное изменение состава минорных ЖК свидетельствует об их экзогенном происхождении
Состав ЖК макроорганизма колеблется в пределах 25% от их среднего значения в разных пробах, а состав микробных маркеров от 0 до максимума в тяжелых случаях воспаления
При проведении этиотропной антибактериальной терапии значения минорных компонентов в крови возвращались к нормальным
Концентрация микробного маркера коррелирует с активностью воспалительного процесса (3-гидрокси-пальмитиновая кислота в крови как маркер Brucella в случае экспериментального бруцеллеза у морских свинок, 72 дневный курс)12
Концентрация микробных маркеров Salmonella в крови пациентов с сальмонеллезом кореллирует со значениями титров антител12
Концентрация 10-гидроксистеариновой кислоты (маркер Сlostridium perfringens) пациентов с синдромом длительного сдавливания и диагнозом “газовая гангрена” коррелирует с наличием и количеством С.perfringens, подтвержденным культуральным методом6
Наконец, клинические наблюдения показывают нормализацию микроэкологического статуса организма человека и подавление инфекции в результате лечебных мероприятий по данным масс-спектрометрии микробных маркеров.
В качестве примера, подтверждающего специфичность маркера приведем результаты поиска маркеров С.perfringens при газовой гангрене6 (табл. 3).
Таблица 3
Сопоставление клинических, бактериологических и ГХ-МС данных диагностики клостридиальной инфекции в сравнении с контрольными
| № | Фамилия, № и.б. | Клинический диагноз | Бактериологич. данные | Концентрация* 10-оксикислот | Летучие кислоты | |
18:0 | 18:1 | |||||
| Г-н, 5229 | Анаэробная клостридиальная флегмона | C.perfringens | 2,4 | 0,0 | масляная | |
| М-н, 5288 | Газовая гангрена | C.perfringens | 5,4 | 0,2 | пропионовая масляная капроновая | |
| М-н, 5272 | Газовая гангрена | Клостридии | 7,8 | 0,0 | масляная валериановая капроновая | |
| П-н, 5248 | Анаэробная клостридиальная флегмона | Клостридии | 5,6 | 6,2 | пропионовая изомасляная масляная | |
| Т-н, 5261 | Анаэробная флегмона | Клостридии | 22,1 | 2,0 | масляная валериановая | |
| Г-н, 5234 | Костная посттравматическая рана | Стафилококк | 0 | 0 | масляная энантовая | |
| О-ва, 5256 | Анаэробная неклостридиальная флегмона | Энтерококк, синегнойная палочка, протей | 0 | 0 | отсутствие | |
| Здоровая ткань | Послеоперационный материал ткани бедра | Не инфицирована | 0 | 0 | отсутствие | |
| Б. | Пептококковая инфекция | Пептококк | 0 | 0 | уксусная пропионовая масляная изовалериановая | |
Экспериментальные данные показывают, что 10-оксикислоты С18 появляются лишь у тех пациентов, у которых бактериологический анализ обнаруживает присутствие клостридий, а клиническая картина соответствует газовой гангрене. В здоровых тканях, а также в тканях с неклостридиальной анаэробной инфекцией эти кислоты отсутсвуют. Все изученные виды клостридий при инфицировании животных вырабатывают 10-оксидекановые кислоты, но вид C.perfringens в несколько раз более активен.
Проведено также тестирование метода масс — спектрометрии микробных маркеров по фекалиям, поскольку микробиота фекалий подробно изучена7,8,69,70. Лидирующим в количественном отношении, по нашим данным, оказался род Eubacterium. Далее по ранжиру следуют клостридии, бактероиды, лактобациллы и бифидобактерии. Их доля составляет 84-94% от суммы по данным МСММ. Аэробы представлены в основном кокками разных таксонов, аэробными актиномицетами (актинобактериями) и микроскопическими грибами. Энтеробактерии, псевдомонады, другие грамотрицательные аэробы и вирусы присутствуют в минорных концентрациях. Данные по микробному сообществу фекалий получены у практически здоровых людей разного пола и возраста. Оказалось, что количественный состав микроорганизмов и их сумма резко индивидуально различны. Вариации по сумме составляют порядок, а по отдельным микробам до двух порядков и более. Например, разница на порядок по бифидобактериям, на два порядка по лактобациллам, на три порядка по пропионовым бактериям, хеликобактеру и Clostridium ramosum. Результат еще раз свидетельствует о нестабильности состава фекалий и, следовательно, проблематичности его использования для оценки изменений микробиоты кишечника: колебания в норме перекрывают патологические сдвиги. Сам факт существования этих микроорганизмов в составе фекалий известен, но из отдельных измерений в разных лабораториях, а также обобщений в руководствах. Данные МСММ подтверждают известные, но сразу по всем микроорганизмам фекалий в одном анализе и с большой точностью по сравнению с культуральным и, пожалуй, генетическим (FISH) методами (табл. 5).
Таблица 5
Сопоставление данных анализа микробиоты фекалий генетическим, культурально-биохимическим и масс-спектрометрическим методами.
| Состав микробиоты фекалий взрослых людей, клеток/г мокрого веса | |||||
| Масс-спектрометрия | Генетический метод, Harmsen, 2002 | Культуральный метод | |||
| Бондаренко, 2003 | Маянский (Schaechter) | Фирма Hoechst | |||
| Общая численность | 0,6-5 1011 | 3,5 1010 | 1010— 1011 | 1010— 1012 | 2 × 1011 |
| Доля анаэробов, % | 84-94 | До 100 | 90-95 | До 100 | 33-100 |
| Eubacterium | 1011 | 7,1 ×109 | 109 – 1010 | 109 – 1012 | 3 × 1010 |
| Бактероиды | 1010 | 9,5 ×109 | 109 — 1010 | 1010 — 1012 | 1011 |
| Клостридии | 6 × 1010 | 7,9 ×109 | 105 — 108 | 105 — 1011 | 3 × 1010 |
| Бифидобактерии | 1010 | 1.7 ×109 | 109 — 1010 | 108 — 1012 | 2 × 108 |
Полученная методом ГХ-МС общая численность микроорганизмов фекалий находится в пределах интервала значений 0,6-5 1011 кл/г, что согласуется с известными литературными данными измерений генетическим и культурально-биохимическим методами. Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по этим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений, в пределах трех-шести порядков. Тем не менее, совпадает оценка о приоритете рода Eubacterium, численность которых имеет порядок 1011 кл/г (109 – 1012 по литературным данным), о количестве бактероидов 1010 кл/г (1010 — 1012 по известным данным), клостридий — 6 х 1010 кл/г (105 — 1011 соответственно), бифидобактерий 1010 кл/г (1010 — 1012), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам и стафилококкам. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными результаты измерений численности микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки и других клинических пробах.
Результаты разных исследований микробиоты фекалий отводят бифидобактериям в их составе почти от 100% до 0,1%. Диапазон в три порядка вряд ли вызван межлабораторной воспроизводимостью — в каждом исследовании приводится серьезная статистика и добросовестная аналитическая процедура. Разницу следует, скорее, отнести к особенностям самого материала и точностью сопоставляемых методов количественных измерений. Не вдаваясь в детали, можно заключить, что эффект доминирования бифидобактерий создает рутинная практика анализа только бифидобактерий, иногда лактобацилл, еще реже — клостридий и бактероидов в сопоставлении с долей условно-патогенной микрофлоры при исследованиях дисбактериозов. Как видно из поля зрения микробиолога при этом выпадают эубактерии, бактероиды и клостридии, которых в фекалиях по современным оценкам по крайней мере в несколько раз больше, чем бифидобактерий. Это заблуждение выглядит естественным, если вспомнить, что в рамках общей микробиологии принято считать, что в микробном сообществе в среднем культивируемыми являются не более 20% микроорганизмов любого местообитания. Что касается фекалий, то по оценкам молекулярно-генетическими методами так же оказывается, что определение 60-80% их микробиоценоза не доступно для культуральных методов исследования. Данные масс-спектрометрии коррелируют с генетическими (в рамках сопоставимости микробиологических количественных измерений) и одинаково показывают, что эубактерий, бактероидов и клостридий вместе и по отдельности на порядок больше, чем бифидобактерий.
С Институтом физико-химической медицины проведено сопоставление данных состава микроорганизмов фекалий людей, определенного метагеномным методом и методом МСММ рис. Как видно из рисунка, получено хорошее с позиции батериологического исследование совпадение результатов. Оба анализа показывают доминирование в материале клостридий и эубактерий. Бактероиды, бифидобактерии и пептострептококки занимают следующий уровень по численности. Но на порядок отличаются результаты по превотеллам, руминококкам, энтеробактериям: по данным МСММ их больше в фекалиях.
Рис. Сопоставление состава микроорганизмов фекалий людей методами метагеномного анализа и МСММ. Состав в процентах от суммы.
Хорошее совпадение результатов бактериологического анализа дает параллельный анализ 96 проб культуры крови, проведенный в НЦ ССХ им А.Н.Бакулева методами посева на питательные среды и масс-спектрометрическим. Анализ и обобщение полученных результатов показали совпадение данных метода ГХ-МС с данными бактериологического метода. При идентификации гемокультур методом ГХ-МС результаты получены в среднем через 3 ч после начала анализа, тогда как при проведении традиционного микробиологического исследования — через 1,5-2 сут. (Попов, 2013). Часть анализов показана в таблице.