Изучение микробного сообщества зева детей с инфекционным мононуклеозом в сочетании с ангинами методом масс-спектрометрии микробных маркеров

По материалам диссертации П.С. Адеишвили (канд. мед. наук) РГМУ г.Москва и статьи в журнале «Детские инфекции», 2012, том 11, № 1, С. 12-16. Использованы также данные к.м.н. врача ЛОР И.Андриановой по аденоидитам (Красноярский федеральный университет) и амбулаторные данные Академической группы Аккад РАМН Ю.Ф.Исакова (НЦ ССХ им А.Н.Бакулева, Москва).

Введение

В силу ряда причин исследование микробиоты зева классическими бактериологическими методами в условиях клинической бактериологичой лаборатории сильно затруднено или полностью невозможно. Реализация задачи требует подключения специализированных лабораторий с арсеналом культуральных и некультуральных методов, позволяющих обеспечить количественный анализ полимикробной инфекции одного больного. Как правило, это требует значительных материальных и временных затрат, не совместимых со стоимостью и временем пребывания больного в стационаре. Еще более важна несовместимость с темпом развития воспалительного процесса. Возникает необходимость внедрения новых экспресс-методов диагностики инфекционного статуса пациента.

Таким методом можно считать метод  масс-спектрометрии микробных маркеров  (МСММ), позволяющий в ускоренном режиме, минуя стадию культивирования и тестовых ферментаций, определить спектр доминирующих микроорганизмов (более 10⁴ клеток в пробе) по молекулярным маркерам – клеточным высшим жирным кислотам, альдегидам и стеринам [Осипов, 2010].

Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из подлежащего исследованию образца, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных, сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных — не более 2,5 часов.

Внедрение МСММ позволяет сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. В этом методе применен математический аппарат количественного реконструирования состава микроорганизмов в очаге воспаления по составу их маркеров в биопробе, что позволяет  контролировать инфекцию в динамике заболевания, а также эффективность лечения.

В период разгара заболевания всем пациентам проводили забор пробы с миндалин бактериологическими тампонами, которые хранили в замороженном состоянии (при -5 ^оС). Для ГХ-МС анализа вату с тампона переносили в реакцинный сосуд (виал) и подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение 45 мин при 80 °С.  Полученные в результате реакции метанолиза микробных липидов жирные кислоты  в виде метиловых эфиров двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80 °С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот и стеролов. В реакционный сосуд добавляли 40 мкл гексана и 2 мкл смеси вводили в инжектор ГХ-МС системы 5850/5973 Agilent Technologies (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP –5MS Agilent.

Анализ и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли по технологии «Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» (разрешение Росздравнадзора ФС 2010/038 от 24.02.2010). Таким способом определяют эффективную (то есть соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность микроорганизмов разных таксонов, в том числе анаэробов, актинобактерий, дрожжей, грибов и вирусов – всего 170 таксонов, введенных в программу скриннига маркеров. В число определяемых по маркерам микроорганизмов входят не только те, что находятся в момент отбора пробы на поверхности очага воспаления, но и находящиеся внутри слоя ткани, из которого химические вещества отмирающих микроорганизмов могут поступать с экссудатом.

Начиная с 60-х годов ХХ века считалось, что поражение ротоглотки при ИМ имеет вирусно-бактериальное происхождение, причем роль микробной инфекции является определяющей, что определяло назначение антибактериальной терапии при ИМ. Однако частое использование антибиотиков при лечении ангин привело к возросшему числу сыпей у детей, в том числе к токсикоаллергическим. Нерациональное  употребление антибиотиков, назначаемых по данным культурального теста на чувствительность, приводит к увеличению антибиотикорезистентных микробных штаммов, а также губительно действует на нормальную микробиоту организма. С другой стороны, одностороннее назначение антибиотиков, нацеленных на культивируемые микроорганизмы, дает приоритет некультивируемым в условиях клинических бактериологических лабораторий микроорганизмам – анаэробам, аэробным актинобактериям, грибам и вирусам. Более того, многочисленные данные показывают, что колонизация слизистых оболочек является полимикробной в норме [Wilson, 2008] а  любая инфекция является полиэтиологичной [Бутов, 2011; Osipov, 2011]. В том числе и при ангине [Brook, 1997; 1999; Chole, 2003]. В этой ситуации тактика антибиотикотерапии должна учитывать качественную и количественную приоритетность отдельных видов в совокупном инфекционном сообществе.  Для реализации такого подхода необходимо применение некультуральных молекулярных методов, которые получили развитие в конце прошлого века.

2. Результаты исследования

Используя метод масс-спектрометрии микробных маркеров оказалось возможным установить по мазкам из зева  наличие микроорганизмов, принадлежащих к 51 таксону (таблица 1). По результатам анализа микробного сообщества пациентов (n=25)  по сравнению со здоровыми донорами (n=10)  обнаружено систематическое клинически значимое (более чем на порядок по сравнению с нормой [Beloborodova, 2000]) увеличение численности бактерий 21 таксона, а именно видов Moraxella, Fusobacterium, Streptococcus (оральные и анаэробные S. mutans), Prevotella, Propionibacterium (P. acnes, P. jensenii, P. freudenreichii), Eubacterium/Clostridium, актинобактерий Streptomyces, Actinomyces Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus anaerobius, вирусов герпеса и других микроорганизмов.

Это означает, что у детей с ИМ имеет место полимикробная инфекция ротоглотки, что проявляется клинически значимым увеличением численности бактерий (на два порядка и более) 27 видов аэробов, анаэробов, актинобактерий грибов и вирусов из исследуемых 56 таксонов , по сравнению с детьми без поражения ротоглотки, а также обнаружено участие нормофлоры в возникновении ангины. Данный факт патогенетически обосновывает назначение лекарственных средств для восстановления мукозального иммунитета и нормализации микробиоты. В том числе дает информацию для этиотропной антибиотикотерапии.
Таблица 1
Усредненный состав и количество микроорганизмов в мазке у  детей с ИМ в разные периоды заболевания  (n=22)
 

• — численность микроорганизмов в ячейках указана для удобства сопоставления, уменьшенными на пять порядков. Таким образом, напр., численность Streptococcus sp. в группе сравнения составляет 2304×10⁵

Рис 1. Диаграммы, построенные по данным таблицы 1 графически в динамике подверждают активное участие Peptostreptococcus anaerobius, Bacteroides fragilis, видов Moraxella/Neisseria, Eubacterium/Cl. coccoides и Bifidobacteriumв инфекционном процессе от минимума в норме, достигая максимума в разгаре и снижаясь в период реконвалесценции.

Концентрация маркеров другой группы микроорганизмов не превышает в среднем уровень колонизации слизистой зева у доноров. К ним относятся представители родов Staphylococcus, Lactobacillus, Streptococcus, коринебактерии, Pseudonocardia, Stenothrophomonas и другие. Микроскопические грибы  (не кандида) —  плесневые, дерматофиты и другие оказываются в дефиците у пациентов.

Следует отметить, что концентрация маркеров части микроорганизмов в слизистой зева доноров больше чем в среднем в крови здоровых людей, что означает повышенную колонизацию зева этими микробами в норме. К ним относятся клостридии группы C. ramosum, Helicobacter, C. perfringens, Prevotella, Bacteroides fragilis и микроскопические грибы (не кандида).

У некоторых доноров можно усмотреть начало инфекции – там, где превышение нормы наблюдается только в отдельных случаях. Ранняя диагностика?

Однако здесь не уместны усреднения. Каждый пациент индивидуален в проявлении инфекции. Поэтому, в ряде случаев за счет усреднения сглаживается участие отдельных представителей – например, стрептококков и псевдомонад. Как видно из гистограмм, приведенных ниже, их активность многократно возрастает у отдельных детей и должна индивидуально учитываться при лечении.

Наибольшая кратность увеличения концентрации маркеров микроорганизмов в мазке отмечена для фузобактерий, бактероидов, стрептомицетов, анаэробного пептострептококка – на два порядка и более по сравнению с нормой. До 30 раз увеличивается численность моракселл и пропионобактерий, на порядок возрастает численность бактерий группы Eubacterium/Clostridium, а также стрептококков, нокардий, превотел, актиномицетов.

Метод МСММ дает возможность определить концентрацию липополисахарида (ЛПС) – эндотоксина грамотрицательных бактерий пересчетом суммы гидрокси-кислот из состава его липида-А, по которым детектируются конкретные батерии этого типа – псевдомонады, моракселлы, бактероиды и другие. Его концентрация составляет 0,1 – 3 наномоля в тампоне и превышают норму до 30 раз у пациентов по сравнению с группой доноров.

Начиная с 60-шестидесятых годов ХХ века превалировало мнение о вирусно-бактериальном происхождении ангины при  ИМ, причем роль микробной флоры являлась определяющей. Данный факт обосновывал назначение антибактериальной терапии при ИМ. Некоторые авторы указывали  на ведущую роль вируса в формировании патологических изменений в зеве и роль патогенных микроорганизмов  в возникновении ангины считали минимальным. Однако сегодня ряд авторов говорят о бактериальном генезе наложений при ИМ, но при этом подчеркивают, что антибактериальная терапия неэффективна. Неэффективность антибиотиков  объясняется, с одной стороны, отсутствием чувствительности основного возбудителя к терапии, с другой — присутствием грибковой флоры в ротоглотке.

Применение метода масс-спектрометрии микробных маркеров объясняет этот кажущийся парадокс. Ведь антибиотики выбирали исходя из данных посева на питательные среды, которые определяли стрептококки, стафилококки и непатогенные нейссерии. Количественные данные метода МСММ показывают, что эти микробы действительно присутствуют в клиническом материале (табл 1), но их количество в основной и контрольной группах одинаково. Это означает, что это нормальная составляющая микробиоты и бороться с ней не надо – только вредить организму, что и подтверждают полученные экспериментальные данные. На самом деле истинными инфекционными агентами являются те, которые обнаруживают наибольшую кратность увеличения численности у больных по сравнению с контролем. Как показано выше (табл 1), наибольшая кратность увеличения концентрации маркеров микроорганизмов отмечена у анаэробного пептострептококка и Porphyromonas spp (в 40 раз),  фузобактерий (в 24 раза), Bacteroides fragilis (17 раз) , стрептомицетов (20 раз). До 30 раз увеличивалась численность моракселл и пропионобактерий, на порядок возрастала численность бактерий группы Eubacterium/Clostridium, а также нокардий, превотел и актиномицетов. Из этого следует, что эффект антибиотикотерапии будет положительным, если она будет адекватной истинным возбудителям.

Учитывая данные МСММ, полученные в этой работе, можно предположить, что доминанты инфекции – пептострептококк, клостридии, эубактерии, другие анаэробы, а также актинобактерии оказались невосприимчивыми к назначенным препаратам. Напротив, угнетение минорной составляющей инфекции — cтафилококки, стрептококки, непатогенные нейссерии – стимулировало конкурентное развитие некультивируемой, основной группы микробных агентов.

Рис. 2. Реконструкция полимикробной инфекции мо методу МСММ в мазке девочки, у которой максимально инфицировано лимфоидно-глоточное кольцо. В колонке «проба» расчетная численность микроорганизмов в клетках на грамм мазка с домножением на 10⁵ степени.

Рис. 3. Реконструкция полимикробной инфекции мо методу МСММ в мазке с миндалин ребенка с хроническим аденоидитом. В колонке «проба» расчетная численность микроорганизмов в клетках на грамм мазка с домножением на 10⁵ степени. Данные врача ЛОР И.Андриановой ( не опубликованы).

 Ниже приведены гистограммы, на которых в виде столбиков отложена численность бактерий, колонизирующих нос и зев при ИМН, ангинах и тонзиллитах в сравнении с нормой и другими патологиями. Слева показана норма крови и зева (у здоровых людей).  Далее:

Здоровый 1-10 – группа детей без респираторных заболеваний
ИМН-ангина – 1-19 – группа детей (n=19) с инфекционным мононуклеозом с ангинами
Нос-контроль 1-5 – здоровые дети
Нос-аденоидит  1-6 – мазок из носа больных с аденоидитом
Миндалина-аденоидит 1-8 – мазок с миндалин
Глотка-аденоидит 1-8 – мазок с задней стенки глотки

Группа данных в правой части гистограммы представляет численность тех же микроорганизмов в мокроте, миометрии матки, смыве трахеи и раневом отделяемом для сравнения.

По оси ординат отложена расчетная численность микроорганизмов по их маркерам в клетках на грамм материала в мазке. Числа на оси надо домножить на коэффициент 10⁵ степени.  Например, число 30000 на следующей за текстом диаграмме соответствует 30000×10⁵ клеток/г, или 3×10⁹ клеток/г.

Как видно, нет системы в участии эубактерий в заболеваниях ЛОР-органов.

Стрептомицеты чаще инфицируют глотку.

Вирус герпеса участвует гораздо активнее при ЛОР-инфекциях, по сравнению с другими патологиями (четыре столбика справа)

Стрептококки явные спутники ангины. И у здоровых тоже – начало инфекции?

Синегнойная палочка часто проявляет активность при ангинах

1. C. perfringensколонизирует глотку в норме и представляет опасность вспышек активности.

Стафилококки – нормальные обитатели зева. Здесь нет случаев их активности в качестве патогенов, кроме раневого отделяемого. Столбик уходит за пределы шкалы.

Анаэробные стрептококки есть в норме, иногда проявляют избыточный рост при патологии

Кандида есть в норме, иногда проявляет избыточный рост при патологии.

Группа Fusobacterium/Haemophylus – активный патоген при ИМН-ангинах

Actinomyces – тоже при при ИМН-ангинах

Микроскопические грибы гибнут при ИМН-ангинах

Превотелла — активный патоген при ИМН-ангинах.
Аналогичные гистограммы для других микроорганизмов можно извлечь из прилагаемого файла Zev-stat2011_РИС.xls.
Примеры анализов из амбулаторной практики.
Пример 1. CF-270_254.  Карпина,  повторный анализ смыва полости рта, в сопоставлении с предыдущим анализом 27.12.2000 (Рис  )

Ведущими микроорганизмами являются анаэробы Peptostreptococcus anaerobius (стало меньше), Propionibacterium (больше), Bacteroides fragilis (существенно меньше), Fusobacterium (стал в норме), Prevotella (существенно меньше).
Значительную группу микроорганизмов представляют  актиномицеты (Streptomyces — пришел в норму,  Nocardia — тоже, Actinomadura — растет),  в комбинации с кокковыми формами  Streptococcus pneumonia (альтернативно, S.agalactiae), Staphylococcus aureus (не изменились), S.epidermidis — вырос.  Enterococcus, по сравнению с предыдущим анализом, пришел в норму.
Следует отдельно обратить внимание на маркеры бактерий рода Moraxella (альтернативно, Neisseria) — заметно уменьшились, а также Helicobacter pylori (без изменений, высокий уровень), который, как показало изучение литературы в связи с этим случаем, известен в патологии изязвлений языка. Концентрация маркера коринебактерий стала ниже нормы.
Наконец, увеличилась концентрация бета-ситостерола, — стерина, характерного для растений и некоторых микроскопических грибов.
Следовательно, в результате первого курса лечения удалось снизить численность анаэробов и актиномицетов, однако сохраняются или растут концентрации маркеров H.pylori, кокковых бактерий и неизвестных микроскопических грибов, связанных с наличием бета-ситостерола и  метаболитов холестерола.
Пример 2. Попова, тяжелая форма инфекции языка с опуханием, изъязвлениями, сильным затруднением приема пищи и дыхания
CF-2006 Попова, по данным анализа слюны и крови  ведущими микроорганизмами являются анаэробы Peptostreptococcus anaerobius, Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Prevotella, Clostridium pefringens, Selenomonas, Propionibacterium, а также   актиномицеты рода Streptomyces. Численность грамположительных кокков  Streptococcus intermedius, Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, S.epidermidis,  Enterococcus снизилась почти до нормального уровня после лечения.
Сохраняется высокая концентрация маркеров бактерий рода Moraxella (альтернативно, Neisseria), а также Helicobacter pylori, который обнаруживают в изъязвлениях языка.
Поверхность языка сильно повреждена. Можно предположить, что эти повреждения связаны с действием токсина стрептомицетов валиномицина (Andersson,     ), который вызывает вспучивание митохондрий, содержащихся в  клетках ткани языка.
CF-2069 Попова, Третий анализ
Микст-инфекция при  заболевании языка по данным анализа слюны и крови
Ведущими микроорганизмами являются анаэробы Peptostreptococcus anaerobius, Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Prevotella,Clostridium pefringens,  Propionibacterium,

а также   актиномицеты родов Streptomyces, Rhodococcus, Nocardia и другие. Численность грамположительных кокков  Streptococcus intermedius, Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, S.epidermidis,  Enterococcus, которая  снизилась почти до нормального уровня после первого курса лечения, снова превышает норму.

Сохраняется высокая концентрация маркеров бактерий рода Moraxella (альтернативно, Neisseria)
Обнаружилось пятикратное превышение нормы маркеров Eubacterium.

CF-2093 Попова, четвертый анализ
 
Появился маркер, отвечающий трем возможным микроорганизмам: Commamonas, Balneathrix  или Acidivorax (предпочтительно — Commamonas)
Ведущими микроорганизмами являются анаэробы Peptostreptococcus anaerobius, Bacteroides fragilis, Fusobacterium, Prevotella, Clostridium pefringens,  Eubacterium.
а также   актиномицеты родов Streptomyces, Rhodococcus, Nocardia и другие. Существенно снизилась численность грамположительных кокков  Streptococcus intermedius, Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, S.epidermidis.
Сохраняется высокая концентрация маркеров бактерий рода Moraxella (альтернативно, Neisseria)
 
Пример 3. Проба MZ-6012   Бе-ер,  хронический тонзиллит     Микробные маркеры в мазке из зева.
 
Воспаление вызвано анаэробной клостридиальной инфекцией в составе группы Clostridium ramosum, а также Clostridium propionicum и Clostridium perfringens, с участием актинобактерий Rhodococcus, Nocardia asteroides, Pseudonocardia и других, а также дрожжей кандида, стафилококков и грамотрицательных микроорганизмов Moraxella/Acinetobacter, Fusobacterium/Haemophylus, Pseudomonas aeruginosa.
 
Актинобактерии (Nocardia, Streptomyces, Rhodococcus) синергически устойчивы в сочетании со стрептококками. Streptococcus mutans — анаэробный стрептококк. Надо воздействовать на актинобактерии. Все изоляты актинобактерий чувствительны к амикацину.
Большинство штаммов родококков чувствительны к гликопептидным антибиотикам, включая ванкомицин и тейкопланин, и к рифампину. Макролиды, такие как эритромицин и кларитромицин также ингибируют рост многих штаммов. Родококки устойчивы к бета-лактамным (за исключением карбапенемов, особенно имипенема) антибиотикам, хотя это свойство не связано с продукцией бета-лактамазы. У имеющих контакт с домашними животными нередко причиной пневмонии и распада легкого является Rodococcus equi. Поскольку это внутриклеточный патоген, антибиотик должен проникать внутрь клеток. В таких случаях длительно применяют комбинацию эритромицина (или других новых макролидов) с рифампицином.
Проба MZ-Plyas    П-ва М.А.     хронический тонзиллит   Микробные маркеры в мазке из зева.
Доминирют лактобациллы, анаэробные стрептококки Streptococcus mutans, актинобактерии  Nocardia sp., Rhodococcus, Streptomyces,  дрожжи  кандида при участии стафилококков и руминококков.

Лактобациллы следует рассматривать как условно-патогенные микроорганизмы. Они чувствительны к эритромицину, клиндамицину, гентамицину, цефотаксиму, амоксициллину, цефтриаксону, ампициллину, ампициллин-сулбактаму, пенициллину-G, но устойчивы к ванкомицину. Отмечается синергический эффект терапии пенициллинами с аминогликозидами. Факторами патогенности лактобацилл считают продуцируемые ими гликозидазы и протеазы. Действительно, по литературным данным они зафиксированы как возбудители при эндокардите, бактериемии, бактериурии, перитонитах, абсцессах и менингитах. Наиболее часто выявляются L. casei и L. rhamnosus (Cannon, 2005). Lactobacillus spp. были изолированы также из нарывов, при пневмонии, бактериемии и коньюктивитах.
Как воздействовать на кандиду, стаффилококки и энтерококки — общеизвестно.
Ключевыми микробами, предположительно, здесь являются лактобациллы и актинобактерии+стрептококки.
Результат лечения: цефтриаксон помог            
 
Ссылки
 
Осипов, Г.А. Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорганизмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. / Химический анализ в медицинской диагностике.- М.: Наука, 2010.- С.293-368.
Beloborodova N.V., Osipov G.A. 2000. Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship. Microb.Ecol.Heal.Dis., SCUP, 12: 12-21.

1. Brook, P. A. Footeand J. Slots. Immune response to Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermediaand other anaerobes in children with acute tonsillitis Journal of Antimicrobial Chemotherapy (1997) 39, 763–769

Brook I., Gober A.E. Interference by Aerobic and Anaerobic Bacteria in Children With Recurrent Group A b-Hemolytic Streptococcal Tonsillitis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 1999;125:552-554.
Chole R.A., Faddis B.T. Anatomical Evidence of Microbial Biofilms in Tonsillar Tissues.  A Possible Mechanism to Explain Chronicity. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003;129:634-636
Wilson M. Bacteriology of humans.  Blackwell Publishing Ltd,  2008
Бутов Ю.С., Полеско И.В., Осипов Г.А., Учайкин В.Ф. и др. Клиническое значение метода хромато-масс-спектрометрии при дерматитах. Учебно-методическое пособие для системы последипломного образования врачей. Утверждено ЦКМС с ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Москва 2011. 60с.
Osipov G.A., Verkhovtseva N.V. Study of human microecology by mass spectrometry of microbial markers. Beneficial Microbes. Volume 2, Number 1 / March 2011 p63-78
Jшrn A. Aas,* Bruce J. Paster, Lauren N. Stokes, Ingar Olsen, and Floyd E. Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity. Dewhirst Journal of Clinical Microbiology, November 2005, p. 5721-5732, Vol. 43, No. 11
 
 
HAROLD MARCOTTE AND MARC C. LAVOIE. Oral Microbial Ecology and the Role of Salivary Immunoglobulin A. MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Mar. 1998, Vol. 62, No. 1, p. 71–109
 
 
 
 
Katherine P. Lemon, Vanja Klepac-Ceraj, Hilary K. Schiffer, et al.
Comparative Analyses of the Bacterial Microbiota of the Human Nostril and Oropharynx . mBio 1(3): e00129-10. doi:10.1128/mBio.00129-10. 2010.
http://mbio.asm.org/content/1/3/e00129-10.full.html
 
25.03.2012
Осипов Георгий Андреевич
дбн, вед научн сотр, профессор
Академическая группа Академика Ю.Ф.Исакова
при НЦ ССХ им А.Н.Бакулева
Тел   8-903-558-31-26 моб
E-mail: osipovga@mail.ru
Web-site: www.rusmedserv.com/microbdiag/