Исследование микробиоценоза ротоглотки методом масс-спектрометрии микробных маркеров у детей с инфекционным мононуклеозом

Учение об инфеционном мононуклеозе (ИМ) в последние годы существенно продвинулось. Установлена полиэтиологичность заболевания. Рекомендовано различать Эптштейна-Барр вирусный мононуклеоз, цитомегаловирусный мононуклеоз,  герпес 6 типа мононуклеоз. Показано, что клиническая картина болезни мало зависит от этиологии мононуклеоза и определяется в основном путем заражения. При проникновении инфекции воздушно-капельным или контактным путем заболевание проявляется вовлечением в процесс глоточного лимфоидного кольца, тогда как при парентеральном заражении тропным органом выступает печень или другие висцеральные органы. Такие представления многое объясняют в клинике заболевания, но по-прежнему остается неясным механизм возникновения экссудативного выпота на слизистой ротоглотки и патогенез ангины. Одни исследователи считают их бактериальными, возникающими за счет активации стрепто-стафилококковой и грибковой флоры, другие — вирусной или вирусно-бактериальной природы . Противоречивые представления о патогенезе нашли отражение в рекомендованных схемах лечения — от обязательного назначения антибактерильных средств до полного их исключения . Отсутствие четких рекомендаций по этому вопросу можно объяснить прежде всего тем, что в полости рта и носа закономерно обнаруживается чрезвычайно разнообразная микробная флора. По данным многочисленных литературных источников, при бактериологическом исследовании в ротовой полости и носоглотке у здоровых людей постоянно обнаруживаются: стрептококки, стафилококки (S. epidermidis, S. Pneumoniae, S. аureus), Enterococcus, Lactobacillus, Actinomices, пептострептококи, Neisseria, Actinomyces, Clostridium, Pseudomonas и другие неферментирующие энтеробактерии. Менее аэриремые части олонизирют анаэробы — бактероиды, фузобактерии, вейлонеллы,актиномицеты, спирохеты родов Leptospira, Borrelia, Treponema, микоплазмы (M. orale, M. salivaru) и разнообразные простейшие.

Нередко бывает трудно провести четкую грань между сапрофитами и патогенными микробами . В свою очередь неограниченная колонизация любым видом бактерии способна привести к развитию инфекционной патологии , а при транслокации микроорганизмов в непривычные места обитания — вызывать различные нарушения. В связи с этим, более углубленное изучение биоценоза ротоглотки при ИМ позволит с новых позиций оценить роль дисбиотических нарушений в развитие ангины при ИМ и патогенетически обосновать терапию.

Однако применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы диагностики дисбиоза имеют определенные ограничения и недостатки. Так при классическом бактериологическом исследовании не представляется возможным оценить роль некультивируемых микроорганизмов в инфекционном процессе. Трудности в диагностике хронических и латентных инфекций могут возникать и при использовании молекулярно-биологических методов, при которых частота ложноположительных результатов и невозможность адекватной количественной оценки резко возрастает. Соответственно для реализации задачи требуется подключение специализированных лабораторий с арсеналом культуральных и некультуральных методов, позволяющих обеспечить количественный анализ полимикробной инфекции в каждом конкретном случае. Как правило, это требует значительных материальных и временных затрат, не совместимых со стоимостью и временем пребывания больного в стационаре. Еще более важна несовместимость с темпом развития воспалительного процесса. Возникает необходимость внедрения новых экспресс-методов диагностики инфекционного статуса пациента.

Таким методом можно считать метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), позволяющий в ускоренном режиме, минуя стадию культивирования и тестовых ферментаций, определить спектр доминирующих микроорганизмов (более 104 клеток в пробе) по молекулярным маркерам — клеточным высшим жирным кислотам, альдегидам и стеринам.

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) позволяют получить уникальную информацию о количестве структурных мономерных химических компонентов, входящих в состав липидов микробной клетки, — жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов, специфичных для таксонов микроорганизмов разного уровня — от вида до семейства . Эти компоненты (маркеры) могут быть определены среди других химических составляющих суммарной биомассы биологических объектов и использованы для детектирования микроорганизмов.

Материалы и методы исследования

Суть анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из подлежащего исследованию образца, их разделении на газовом хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных, сам процесс анализа занимает 30 мин, а с учетом времени пробоподготовки и расчета данных — не более 2,5 часов.

Внедрение МСММ позволяет сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. В этом методе применен математический аппарат количественного реконструирования состава микроорганизмов в очаге воспаления по составу их маркеров в биопробе, что позволяет контролировать инфекцию в динамике заболевания, а также эффективность лечения.

Анализ и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли по технологии «Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» (разрешение Росздравнадзора ФС 2010/038 от 24.02.201 0). Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе с использованием внутреннего стандарта. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах ЕХСЕL. Для количественного расчета использовали данные калибровки по дейтерированной тридекановой кислоте. Таким способом определяли эффективную (то есть соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность микроорганизмов разных таксонов, в том числе анаэробов, актинобактерий, дрожжей, грибов и вирусов — всего 170 таксонов, введенных в программу скриннига маркеров. В число определяемых по маркерам микроорганизмов входят не только те, что находятся в момент отбора пробы на поверхности очага воспаления, но и находящиеся внутри слоя ткани, из которого химические вещества отмирающих микроорганизмов могут поступать с экссудатом.

    Под нашим наблюдением находились 22 ребенка с диагнозом инфекционный мононуклеоз, в возрасте от 3-х до 14 лет. Группу сравнения составили 10 детей без клинических признаков острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ), гиперемии слизистой ротоглотки и миндалин, которые находились на лечении в офтальмологическом отделении МДГКБ г. Москвы с диагнозами: миопия, травма глаза, увеит, помутнение роговицы, перелом орбиты.

В период разгара заболевания всем пациентам проводили забор пробы с миндалин бактериологическими тампонами, которые хранили в замороженном состоянии (при -5 °С).

Таблица 1. Реконструированный по методу МСММ состав микроорганизмов в мазке (на тампоне) пациента М.В., 14 лет, с диагнозом инфекционный мононуклеоз (размерность — число микробных клеток с домножением на коэффициент 105)

Результаты и их обсуждение

У всех детей с ИМ диагностировалось средне-тяжелое состояние с типичными клиническими проявлениями: лихорадка, наложения на миндалинах, болезненность при глотании, увеличение размеров лимфатических узлов, гепатоспленоменгалия, количественные и качественные изменения мононуклеаров, положительный Лайм-тест. У 19 детей (86,4%) начало заболевания было острым, у остальных (1-3,6%) отмечалось постепенное нарастание симптомов интоксикации.

Используя метод масс-спектрометрии микробных маркеров, оказалось возможным установить в ротоглотке наличие микроорганизмов, принадлежащих к 56 таксону. Результаты сравнительного анализа микробного сообщества в смывах из миндалин у детей с ИМ (п = 22) показали систематическое клинически значимое увеличение численности бактерий 27 таксонов, по сравнению с детьми без поражения ротоглотки (п = 10). К ним относились следующие виды микроорганизмов: Moraxella, Fusobacterium, Streptococcus (оральные и анаэробные S. mutans), Prevotella, Propionibacterium (P. acnes, P. jensenii, P. Freudenreichii), группа видов Eubacterium/Clostridium, актинобатерий Streptomyces, Actinomyces Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus anaerobius, вирусы герпеса и другие микроорганизмы. Наибольшая кратность увеличения концентрации маркеров микроорганизмов — на два порядка и более, выше концентрации маркеров в группе сравнения в мазке у детей с ИМ, отмечена для фузобактерий, бактероидов, стрептомицетов, анаэробного пептострептококка. До 30 раз увеличивалась численность моракселл и пропионобактерий, на порядоквозростала численность бактерий группы Eubacterium/Clostridium, а также стрептококков, нокардий, превотел, актиномицетов.

Концентрация маркеров других микроорганизмов не превышала в среднем уровень колонизации слизистой зева у детей группы сравнения. К ним относились представители родов Staphylococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, , часть клостридий, Pseudonocardia. Микроскопические грибы (не кандида) — плесневые, дерматофиты и другие оказались в дефиците у детей с ИМ, по сравнению с детьми без ИМ.

Таким образом, данные, полученные методом МСММ, позволили верифицировать и количественно определить состав микробного сообщества в ротоглотке при ИМ у детей.

Выявленные изменения позволяют рассматривать ангину при ИМ скорее всего как заболевание, обусловленное ассоциацией различных условно-патогенных микроорганизмов, концентрация которых превышает численность микробов у здоровых детей минимум на 2 порядка. Доказательство наличия дисбиоза у детей с ангинами при ИМ открывает новые перспективы в расширении этиотропной и патогенетической терапии этого заболевания, направленной с одной стороны на ликвидацию избыточного роста условно-патогенной флоры, а с другой — на нормализацию количественного и качественного состава микробиотопа ротоглотки. В качестве примера приводим следующее наблюдение.

Мария В., 14 лет (история болезни № 20852) поступила в клинику 29/1Х-2011 года с диагнозом: «Инфекционный мононуклеоз».

Ребенок от I беременности, протекавшей с угрозой прерывания. Роды срочные, физиологические. Вес при рождении 3550 г, длина — 54 см. На грудном вскармливании до 1 года, развивался нормально, профилактические прививки получала по календарю. Перенесла ОРВИ, ветряную оспу.

Заболела остро 26/1Х, когда поднялась температура до 38 °С, появилась боль в горле. 28/1Х (3 день болезни) на фоне фебрильной температуры диагностирована ангина. 29/1Х (4 день болезни) госпитализирована в МДГКБ. До госпитализации девочка медикаментозную терапию не получала.

При осмотре состояние среднетяжелое, фебрильно лихорадит до 39 °С, аппетит снижен. Кожа бледная, чистая. Пальпируются увеличенные до 2 см шейные лимфоузлы, подвижные, безболезненные. Носовое дыхание затруднено, в носовых ходах — слизь. В легких хрипов нет. Тоны сердца звучные, ритмичные. Зев гиперемирован, отечный, миндалины увеличены до III степени, в лакунах бело-желтые наложения. Живот мягкий, безболезненный, печень выступает ниже реберного края на 2 см, селезенка — на 1 см. Стул и диурез в норме.

Лихорадка сохранялась до 3/Х (8 день болезни), наложения на миндалинах — до 5/Х (10 день болезни).

С 4/Х (9 день болезни) отмечено улучшение состояния, аппетита, носового дыхания. 6/Х (11 день болезни) ребенок был выписан домой в удовлетворительном состоянии на амбулаторное долечивание. При осмотре оставались увеличенными шейные лимфоузлы до 0,8 см, незначительная гиперемия слизистых ротоглотки, увеличение миндалин до II степени, без наложений, печень пальпировалась на 1 см ниже реберного края.

Анализ крови 29/!Х (4 день болезни): НВ — 129 г/л, Эр — 4,24 х 1012/л, Л — 11,6 х 109/л, п — 2%, с — 27%, л —19%, м —12%, Тр — 166 х 109/л, СОЭ — 20 мм/час, атипичные мононуклеары — 40%. Анализ крови 4/Х (9 день болезни): НВ —135 г/л, эр — 4,43 х 1012/л, Л — 6,3 X 109/л, с — 30%, л — 30%, м — 2%, Тр — 209 х 109/л, СОЭ — 13 мм/час, атипичные мононуклеары — 20%.

Биохимический анализ крови 30/М (5 день болезни): белок — 75 г/л, АлАТ — 172 ед/л , АсАТ — 121 ед/л.Посев из зева на дифтерию от 29/К (4 день болезни) — отрицателен. Результаты посева из зева на флору методом ХМСМ от 29/К (4 день болезни) представлены в таблице 1.

Как видно из данных таблицы, у ребенка с ИМ имел место дисбиоз ротоглотки на фоне лакунарной ангины. По данным МСММ отмечалось клинически значимое увеличение численности бактерий 26 из исследуемых 56 таксонов.

Заключение

Поражение ротоглотки принято считать важнейшим клиническим признаком инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусами семейства Герпес. Однако до сих пор не разработаны методы этиотропной терапии данного заболевания, что связано, в первую очередь, с отсутствием однозначного ответа о природе ангины при ИМ. Результаты наших исследований, полученных методом хрома- то-масс-спектрометрии, позволили выявить полимикробную инфекцию ротоглотки у детей с ИМ за счет более чем двукратного превышения нормальных значений численности бактерий 27 таксонов, что мы склонны трактовать как декомпенсированный дисбиоз. При этом мы не выявили этиопато- генетическую роль какого-либо конкретного бактериального патогена. Можно предположить, что в патогенезе ангины при ИМ значимую роль играет совокупность многих условно-патогенных представителей микрофлоры, действующих в условиях вирусного поражения лимфоидных образований ротоглотки. Можно предположить, что синдром ИМ возникает при попадании вируса семейства Герпес (Эпштейна-Барр вирус, цитомегаловирус, герпес 6 типа) в лимфоидные образования рото-носоглотки (тропный орган), в результате чего запускается лимфопролиферативная линия патогенеза, снижается защитная роль мукозального иммунитета, активизируются колонисты небных миндалин, вследствие чего возникает дис- биоз. Полученные данные дают основание для назначения препаратов, предназначенных для коррекции микробиоценоза ротоглотки.

Выводы

1. Поражение ротоглотки и синдром ангины при инфекционном мононуклеозе имеют вирусно-бактериальную природу и являются следствием развития дисбиоза, связанного с повышением концентрации многих представителей нормофлоры (полимикробной инфекции) в условиях вирусной персистенции.
2. Наличие дисбиоза в ротоглотке у детей с ИМ патогенетически обосновывает назначение лекарственных средств для восстановления мукозального иммунитета и нормализации микрофлоры.

В случае клинических проявлений ангины при ИМ следует назначать подробное микробиологическое исследование (например — методом масс-спектрометрии микробных маркеров) для выявления агентов полимикробной инфекции с целью определения тактики лечения.

© П. С. Адеишвили, И. В. Полеско, Г. А. Осипов, Н. Ф. Федосова, Н. А. Гусева, И. Е. Колтунов, В. Ф. Учайкин, В. Я. Полеско. Журнал «Детские инфекции» 2012, №1