Верификация метода МСММ

В пользу микробного происхождения жирных кислот, альдегидов и стеринов, не характерных для клеток организма человека, свидетельствуют следующие соображения и факты.
Хорошо известно, что  в клетках млекопитающих  отсутствуют гидрокси, циклопропановые и ненасыщенные ЖК
В результате проведенных нами  анализов (несколько тысяч) биологических жидкостей человека и животных было определено, что динамичное изменение состава минорных ЖК свидетельствует об их экзогенном происхождении
Состав ЖК макроорганизма колеблется в пределах 25% от их среднего значения в разных пробах, а состав микробных маркеров от 0 до максимума в тяжелых случаях воспаления
При проведении этиотропной антибактериальной терапии значения минорных компонентов в крови возвращались к нормальным
Концентрация микробного маркера коррелирует с  активностью воспалительного процесса (3-гидрокси-пальмитиновая кислота в крови как маркер Brucella  в случае экспериментального бруцеллеза у морских свинок, 72 дневный курс)¹²
Концентрация микробных маркеров Salmonella в крови пациентов с сальмонеллезом кореллирует со значениями титров антител¹²

Концентрация 10-гидроксистеариновой кислоты (маркер  Сlostridiumperfringens) пациентов с синдромом длительного сдавливания и диагнозом “газовая гангрена” коррелирует с наличием и количеством С.perfringens, подтвержденным культуральным методом⁶

Наконец, клинические наблюдения показывают нормализацию микроэкологического статуса организма человека и подавление инфекции в результате лечебных мероприятий по данным масс-спектрометрии микробных маркеров.

В качестве примера, подтверждающего специфичность маркера приведем результаты поиска маркеров С.perfringens при газовой гангрене⁶ (табл. 3).

Таблица 3
Сопоставление клинических, бактериологических и ГХ-МС данных диагностики клостридиальной инфекции в сравнении с контрольными

 
Экспериментальные данные показывают, что 10-оксикислоты С18 появляются лишь у тех пациентов, у которых бактериологический анализ обнаруживает присутствие клостридий, а клиническая картина соответствует газовой гангрене. В здоровых тканях, а также в тканях с неклостридиальной анаэробной инфекцией эти кислоты отсутсвуют.  Все изученные виды клостридий при инфицировании животных вырабатывают 10-оксидекановые кислоты, но вид C.perfringens в несколько раз более активен.

Проведено также тестирование метода масс — спектрометрии микробных маркеров по фекалиям, поскольку микробиота фекалий подробно изучена^7,8,69,70. Лидирующим в количественном отношении, по нашим данным, оказался род Eubacterium. Далее по ранжиру следуют клостридии, бактероиды, лактобациллы и бифидобактерии. Их доля составляет 84-94% от суммы по данным МСММ. Аэробы представлены в основном кокками разных таксонов, аэробными актиномицетами (актинобактериями) и микроскопическими грибами. Энтеробактерии, псевдомонады, другие грамотрицательные аэробы и вирусы присутствуют в минорных концентрациях. Данные по микробному сообществу фекалий получены у практически здоровых людей разного пола и возраста. Оказалось, что количественный состав микроорганизмов и их сумма резко индивидуально различны. Вариации по сумме составляют порядок, а по отдельным микробам до двух порядков и более. Например, разница на порядок по бифидобактериям, на два порядка по лактобациллам, на три порядка по пропионовым бактериям, хеликобактеру и Clostridiumramosum. Результат еще раз свидетельствует о нестабильности состава фекалий и, следовательно, проблематичности его использования для оценки изменений микробиоты кишечника: колебания в норме перекрывают патологические сдвиги.  Сам факт существования этих микроорганизмов в составе фекалий известен, но из отдельных измерений в разных лабораториях, а также обобщений в руководствах.  Данные МСММ подтверждают известные, но сразу по всем микроорганизмам фекалий в одном анализе и с большой точностью по сравнению с культуральным и, пожалуй, генетическим (FISH) методами (табл. 5).

Таблица 5
Сопоставление данных анализа микробиоты фекалий генетическим, культурально-биохимическим и масс-спектрометрическим методами.

 
Полученная методом ГХ-МС общая численность микроорганизмов фекалий находится в пределах интервала значений 0,6-5´ 10¹¹кл/г, что согласуется с известными литературными данными измерений генетическим и культурально-биохимическим методами. Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по этим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений,в пределах трех-шести порядков. Тем не менее, совпадает оценка о приоритете рода Eubacterium, численность которых имеет порядок  10¹¹кл/г (10⁹ – 10¹² по литературным данным),  о количестве бактероидов 10¹⁰кл/г (10¹⁰ — 10¹² по известным данным), клостридий — 6 х 10¹⁰кл/г (10⁵ — 10¹¹ соответственно), бифидобактерий 10¹⁰кл/г (10¹⁰ — 10¹²), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам  и стафилококкам. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными результаты измерений  численности микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки и других клинических пробах.

Результаты разных исследований микробиоты фекалий отводят бифидобактериям в их составе почти от 100% до 0,1%.  Диапазон в три порядка вряд ли вызван межлабораторной воспроизводимостью — в каждом исследовании приводится серьезная статистика и добросовестная аналитическая процедура. Разницу следует, скорее, отнести к  особенностям самого материала и точностью сопоставляемых методов количественных измерений. Не вдаваясь в детали, можно заключить, что эффект доминирования бифидобактерий создает рутинная практика анализа только бифидобактерий, иногда лактобацилл, еще реже — клостридий и бактероидов в сопоставлении с долей условно-патогенной микрофлоры при исследованиях дисбактериозов. Как видно из поля зрения микробиолога при этом выпадают эубактерии, бактероиды и клостридии, которых в фекалиях по современным оценкам по крайней мере в несколько раз больше, чем бифидобактерий. Это заблуждение выглядит естественным, если вспомнить, что в рамках общей микробиологии принято считать, что в микробном сообществе в среднем культивируемыми являются не более 20% микроорганизмов любого местообитания. Что касается фекалий, то по оценкам молекулярно-генетическими методами так же оказывается, что определение 60-80% их микробиоценоза не доступно для культуральных методов исследования. Данные масс-спектрометрии коррелируют с генетическими  (в рамках сопоставимости микробиологических количественных измерений) и одинаково показывают, что эубактерий, бактероидов и клостридий вместе и по отдельности на порядок больше, чем бифидобактерий.

С Институтом физико-химической медицины проведено сопоставление данных состава микроорганизмов фекалий людей, определенного метагеномным методом и методом МСММ рис.  Как видно из рисунка, получено хорошее с позиции батериологического исследование совпадение результатов. Оба анализа показывают доминирование в материале клостридий и эубактерий. Бактероиды, бифидобактерии и пептострептококки занимают следующий уровень по численности. Но на порядок отличаются результаты по превотеллам, руминококкам, энтеробактериям: по данным МСММ их больше в фекалиях.

Рис. Сопоставление состава микроорганизмов фекалий людей методами метагеномного анализа и МСММ. Состав в процентах от суммы.
 
Хорошее совпадение результатов бактериологического анализа дает параллельный анализ 96 проб культуры крови, проведенный в НЦ ССХ им А.Н.Бакулева методами посева на питательные среды и масс-спектрометрическим.  Анализ и обобщение полученных результатов показали совпадение данных метода ГХ-МС с данными бактериологического метода. При идентификации гемокультур методом ГХ-МС результаты получены в среднем через 3 ч после начала анализа, тогда как при  проведении традиционного микробиологического исследования — через 1,5-2 сут. (Попов, 2013). Часть анализов показана в таблице.
 
Идентификация Clostridium ramosum при моноинфекции мочи как подтверждение достоверности метода МСММ

Clostridium ramosum (Holdeman, 1971. Синонимы: Bacillus ramosus(1898), Nocardia ramose (1931),  Ramibacterium ramosum (1938) и ее группа (C. inocuum, C. clostridioforme), отличается высоким содержанием в мембране  7-гексадеценовой (16:1 ω9) кислоты.

На самом деле этим маркером обединена группа клостридий, включающая также C. sordelii, C. septicum, C. subterminale, C. fallax, C. difficile, C. paraputrificum, C. celatum, C. cochlearum, C. limosum. Это вещество отсутствует в ключевых клетках человека (Alexander), отсутствует в химическом фоне аналитической процедуры, но встречается  у бактерий рода Streptococcus и метилотрофных бактерий сем. Methylomonadaceae.

Для доказательства принадлежности маркера 16:1 ω9 клостридиям группыC. ramosum могут быть использованы следующие дополнительные мероприятия.
Маркер 16:1 ω9 бывает доминантным в биологических жидкостях, бедных клеточным материалом организма-хозяина. Это моча и ликвор. На диаграмме рис 1 показан результат реконструкции состава микроорганизмов по микробным маркерам в моче девочки Б-вой, 11 лет, больной пиелонефритом (ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова, 1 терапевтическое отделение, индекс анализа NUF-226). Этот результат рутинного обследования приведен, чтобы показать, что маркер, приписываемый C. ramosum имеет 30-кратное превышение нормы и на порядок выше маркеров других участников инфекционного процесса – клостридий других видов и актинобактерий родов Rhodococcus, Pseudonocardia и других. В этом случае можно ожидать очевидного совпадения распределения концентраций полного профиля ЖК подозреваемого микроорганизма в моче с профилем жирных кислот его же в чистой лабораторной культуре.

Рис 1. Реконструкция состава микроорганизмов по микробным маркерам в моче

Действительно, сопоставление распределения ключевых маркеров клостридий C. ramosum с их  соотношением в моче ребенка показывает совпадение профилей с коэффициентом корелляции 0,645 по алгоритму идентификации микроорганизмов по составу ЖК (Microbial Identification System, MIDIInc., Delaware), что означает совпадение на видовом уровне.

Рис.2. Сопоставление распределения ключевых маркеров клостридийC. ramosum с их  соотношением в моче ребенка. Приведена общепринятая аббревиатура жирных кислот и альдегидов. Последние отмечены буквой а в конце символа.
 
Нет необходимости проводить аналогичные графические или иные количественные сопоставления для стрептококков или метилотрофов сем. Methylomonadaceae, как альтернативы C. ramosum, поскольку они не содержат жирных альдегидов в составе клеточной стенки.
Такого рода идентификация клостридий известна в клинической практике:
Allen S.D., Siders J.A., Riddell M.J., Fill J.A. and Wegener W.S. (1995). Cellular
fatty acid analysis in the differentiation of Clostridium species in the clinical
microbiology laboratory. Clin.Infect. Dis. 20 (Suppl. 2), S 198-S 201.
 
Местообитание и клиническая значимость
Clostridiumramosum – вид бактерий рода Clostridium; один из возбудителей газовой гангрены. Вызывает газовую гангрену в ассоциации с другими анаэробами. Выделен из фекалий детей и взрослых, из шейки матки.C. ramosum – полиморфные неподвижные грамположительные или грамотрицательные палочки размером 0,5-0,9 х 2-12,8 мкм, образуют круглые, чаще – терминальные споры. Облигатные анаэробы:
Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред А.А. Воробьева и А.С. Быкова. – М., Медицинское информационное агентство, 2003. – 236 с.: ил.
 
Известный исследователь анаэробов в клинической практике I.Brook (Department of Pediatrics, Georgetown University School of Medicine, Washington, DC.) выделил 107 изолятов клостридий (7.0% от общего числа изолятов) от 96 детей. В их числе 43 (38%) неидентифицированных Clostridium spp., 37 (33%) C. perfringens, 13 (12%)C. ramosum, 5 (4%) C. innocuum, шесть (5%) C. botulinum, три (3%) C.difficile, два (2%) C. butyricum [2]. Большинство клостридиальных изолятов были выделены из абсцессов (38), при перитонитах (26), бактериемии (10), и хроническом отите (7).
Brook, I. Bacterial studies of peritoneal cavity and postoperative surgical wound drainage following perforated appendix in children.Annals of Surgery.1980; 192:208–12.

1. Brook.Clostridial infection in children.J. Med. Microbiol. — Vol. 42 (1995), 78-82

С. ramosum обладает близкой  к C. perfringens активностью, в том числе также может вызывать газовую гангрену, язвенный и некротизирующий колиты. Они известны как агенты септицемии, нефропатии, бактериемии и менингита.
 
Методом ГХ-МС проведено сопоставительное с культуральным методом определение микроорганизмов в выпоте пациентов с гнойным гангренозным аппендицитом.
Н.Б.Бойко, Г.А.Осипов, Н.В.Белобородова, В.А.Курчавов Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и перитонеальном экссудате брюшной полости при гангренозно-перфоративном аппендиците. Инфекции в хирургии. Том 7, №2, с. 58, 2009.
 
Обнаружены маркеры Clostridium perfringens, Enterococcus, Mycobacteria, Streptomyces, Enterobacteriaceae members, Bacteroides fragilis, Eubacterim, Helicobacter pylory, Klebsiella, а также стафилококков, дифтероидов и других микроорганизмов. Культурально-биохимическим методом в выпоте обнаружены E.coli, Peptostreptococcus sp., Bacteroides sp., Candida albicans, , Pseudomonas aeruginosa, Fusobacterium sp. анаэробные грам-положительные палочки и другие микроорганизмы.
Таблица 3
Сопоставление частоты выявляемости микроорганизмов методом ГХ-МС и посевом на селективные среды
 

 
Проведено сопоставление методов ГХ-МС и культурально-биохимического  при исследовании микробной этиологии инфекционного эндокардита
О.Н. Хабиб, «Молекулярные маркеры бактерий в ткани клапанов сердца при инфекционном эндокардите», Дисс. Канд.Мед.Наук. Москва, 2003 г., «микробиология»
Исследование направлено в сторону подтверждения наличия в пробах инфицированного клапана микрооганизмов, определенных по маркерам методом ГХ-МС. Поэтому предприняты специальные усилия для получения чистых культур возможно большего количества микроорганизмов. Дополнительно закуплены питательные среды и организован посев материала клапанов в анаэробных условиях и пр. Но идентификация изолятов проведена в основном опять же методом газовой хроматографии – на приборе Шерлок (MIDI Inc., США), или ГХ-МС, поскольку в штатном режиме клиническая бактериологическая лаборатория не имела возможности идентифицировать какие-либо анаэробы, а из аэробов только стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, псевдомонады, грибы кандида и некоторые другие организмы.
В сводной таблице  4 приведены микроорганизмы, верифицированные классическим культурально-биохимическим методом  в образцах клапанного эндокарда в сопоставлении с данными прямого ГХ-МС анализа образцов ткани.
Таблица 4
 Сопоставление данных культурально-биохимической диагностики с данными ГХ-МС анализа (n=13)

 
Например, у пациентки с ИЭ (А; 32 г.б ИБ № 3354) выявлены 12 микроорганизмов, включая несколько видов  традиционных стафилококков и стрептококков, а также C.hominis и 5 видов анаэробов. У пациентки с ВПС (В; 7 лет ИБ № 3425) выявлены 7 возбудителей, включая 4 анаэроба.
Т.о., расширенное бактериологическое исследование с использованием селективных сред предоставляет реальную возможность фиксировать одновременный рост нескольких видов аэробных и анаэробных микроорганизмов в исследуемых образцах эндокарда. Список микроорганизмов, идентифицированных классическим методом, лишь на несколько видов короче списка микроорганизмов, верифицированных методом молекулярной диагностики. Известно, что приемы культивирования таких анаэробов, как Eubacterium spp., Bifidobacterium spp., Clostridium spp. практически освоены на базе единичных лабораторий и не применяются в практике клинических исследований. Культивирование видов Nocardia spp., Rohodococcus spp., Streptomyces spp.  также требует специальных приемов и навыков.
Факт выявления у одного и того же пациента нескольких трудно-культивируемых классическим методом микроорганизмов в результате целенаправленного, но трудоемкого и дорогостоящего исследования, подтвердил целесообразность поиска и применения новых альтернативных диагностических технологий, в частности, ГХ-МС.