ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА И ИХ КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) известен двадцать лет. Он описан в ряде научных публикаций, диссертациях и методической литературе. Он прошел регистрацию в Росздравнадзоре  и разрешен к применению  в качестве новой медицинской технологии в медицинских учреждениях на территории Российской Федерации (“Оценка микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии”, разрешение ФС № 2010/038 от 24.02.2010). Метод МСММ только  начал формироваться как инструмент клинического рутинного анализа и мониторинга микроэкологического статуса, инфекции и дисбиозов в клинической и амбулаторной практике. Описание технологии МСММ в таком аспекте требует иного, чем было сделано ранее, подхода к введению клинических лаборантов и врачей в метод. Подробно дается обоснование видовой специфичности состава жирных кислот и (жирных) альдегидов клеточной стенки микроорганизмов как основы их видовой дифференциации в чистой культуре. Приводится объяснение выбора молекулярных маркеров для их детектирования в крови и другом клиническом материале с целью дальнейшей  реконструкции состава микробного сообщества (микроэкологии) человека по крови или расчет состава полимикробной инфекции в органах по материалу из очага воспаления – моче, ликвору, мокроте, экссудату, дренажу и аналогичным пробам, содержащим химическую информацию о микробах.
Mass spectrometry of microbial marker’s (MSMM) method is known twenty years. It is described in a number of scientific publications, theses, book chapters and methodical literature. It was registered and allowed for use as new clinical technology in medical institutions in the territory of the Russian Federation («An assessment of the microecological status of the person by a gas chromatography — mass spectrometry method «, permission of Roszdrafnadzor FS No. 2010/038 of 24.02.2010). Nevertheless, the publication in the journal devoted to clinical laboratory diagnostics, remains actual as the method only started being formed as the tool of the clinical routine analysis and monitoring of the microecological status, an infection and disbiosis in clinical and out-patient practice. The MSMM technology description in such aspect demands other, than was made earlier, approach to introduction of clinical laboratory assistants and doctors in a method. Here in more detail justification of the genera specificity the fatty acids and fatty aldehydes composition of the microorganism’s cell wall as bases of their specific differentiation in pure culture is given. The explanation of a choice of molecular markers for their detecting in blood and other clinical material for the purpose of further reconstruction the structure of microbial community (microecology) of the person is offered. The material from the inflammed organ – urine, likvor,  phlegm, exudate, drainage and the similar objects containing chemical information on microbes can be used for the analysis.
 
В основе метода МСММ — высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов. Как оказалось, они могут быть обнаружены в крови и другом клиническом материале высокочувствительным и селективным методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС) на доминирующем фоне липидных веществ самого материала. Метод позволяет одновременно измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале: крови, моче, биоптатах и других биологических жидкостях и тканях, а также в небиологических пробах, минуя стадии предварительного посева на питательные среды или использование тестовых биохимических материалов. Бактериям свойственно большое разнообразие ЖК и жирных альдегидов. В настоящее время их насчитывают более двухсот пятидесяти. В организме человека их всего около двадцати пяти.  Это обстоятельство определяет возможность родового или видового анализа состава инфекций и формы дисбиозов на преобладающем фоне биологической жидкости непосредственно в клиническом материале. Специфичность клеточных ЖК микроорганизмов в сравнении с высшими организмами показана на  рис 1.

Рис 1. Многообразие липидных компонент клеток.  Животные, растения и микроорганизмы разных царств и родов имеют как общие, так и отличительные структурные компоненты липидов.
 
Известно, что состав жирных кислот микроорганизмов видоспецифичен и используется для их идентификации в чистой культуре [1-3], Его информативность и специфичность на уровне вида, показана в ряде обзоров и монографий [2,4,5-8]. Жирнокислотный состав особенно специфичен, если он дополнен оксикислотами и другими липидными компонентами — альдегидами, углеводородами, стеринами, которые методически, как правило, экстрагируют вместе с алифатическими жирными кислотами в органической фракции. Логично искать маркеры микроорганизмов в объектах их среды обитания, например, в фекалиях, мазках из зева, слюне, мокроте, гнойном отделяемом. Оказалось, что они присутствуют и в крови.
При ГХ-МС исследовании фракций ЖК, стеролов и жирных альдегидов в пробах крови пациентов найдено, что основными компонентами (на уровне содержания более 1 % от максимального пика в хроматограмме)  являются четные  кислоты с 12 — 18 атомами углерода: олеиновая С18:1, пальмитиновая С16:0, линолевая С18:2, стеариновая С18:0, пальмитолеиновая С16:1, а также полиненасыщенные ЖК С20:n, С22:n, холестерин, насыщенные прямоцепочечные альдегиды и 2-гидроксикислоты. Их полные названия приведены в таблице 1, а расшифровка аббревиатуры в ссылке под ней. Иногда величину 1 % превышает содержание длинноцепочечных кислот С20 — С26. Нечетные кислоты — пентадекановая С15:0 и гептадекановая (маргариновая) С17:0 составляют около 1 %  каждая. Перечисленные выше вещества являются липидными компонентами клеток организма человека. Кроме того, обнаруживаются ЖК, специфичные клеткам микроорганизмов, обитающих в теле человека. Это разветвленные четные ЖК i14, i16 и нечетные i15 и a15, i17 и a17, ненасыщенные ЖК с необычным для млекопитающих положением двойной связи 16:1ω9, 18:1ω7, 17:1. Их происхождение связано с микроорганизмами, населяющими тело человека, в основном – кишечник.
Мало изучены возможности метода маркера в детектировании микроорганизмов непосредственно в биологической жидкости без выделения чистых культур. Известна диагностика кандидомикоза по арабинитолу [9-11]. Неспецифическая диагностика бактерий по мурамовой кислоте в крови [12. Попытки обнаружения микроорганизмов, содержащих b-оксимиристиновую кислоту [13], диагностика видов Haemophylus  по специфическим оксикислотам [14,15], дифференциация видов Campylobacter [16], контроль менингококка по наличию  b-гидрокси-лауриновой кислоты в крови [17]. Всего в процессе разработки метода МСММ в разных биологических жидкостях человека было обнаружено более 170 веществ микробного происхождения. Часть из них приведена в таблице 1 с отнесением к наиболее часто встречающимся микроорганизмам.
Наиболее удобны для масс-спектрометрического детектирования гидроксикислоты липополисахарида (ЛПС) грамотрицательных бактерий, так как их спектры имеют сильные линии, отличные от линий масс-спектра других кислот и компонентов фона. Это важно в диагностике инфекционных процессов и при определении концентрации эндотоксина этой группы бактерий.
ЛПС является эндотоксином клеточной стенки грамотрицательных бактерий и содержит ряд факторов патогенности этих бактерий. Организм человека из всех живых существ наиболее чувствителен к бактериальным эндотоксинам. При этом липид А обладает наибольшей токсической активностью. Компоненты ЛПС — гидроксикислоты жирного ряда (от 10 до 20 атомов углерода) являются примером информативности химических маркеров. Они не только позволяют формально дифференцировать микроорганизмы, но и по существу связаны с функциональностью антигена: эндотоксические функции заключены в составе и строении липида А, причем О-связанные остатки жирных кислот определяют пирогенность, а N-связанные — летальную токсичность [18]. Если удалить жирные кислоты, то ЛПС полностью теряет активность.
Первоначально исследователи, использовавшие метод ГХ-МС, наблюдали β-гидрокси-миристиновую кислоту (3h14) в режиме масс-фрагментографии – детектировании только одного, самого интенсивного иона в ее спектре. Этот вариант анализа  позволяет более чем на порядок увеличить чувствительность прибора. Считалось, что она является маркером кишечной палочки E.coli. Позже, по мере изучения структуры ЛПС  других бактерий было найдено, что 3h14 присутствует в клетках всех представителей сем. Enterobacteriaceae, а также у бактерий многих других таксонов (строка 35 в таблице 1). Установить, кому именно принадлежит найденная в анализе кислота 3h14 можно с использованием других маркерных веществ. Например, одновременное наличие в пробе циклопропан-гептадекановой кислоты (17сyc) выделяет представителей сем. Enterobacteriaceae. Эта пара найдена в анализе мочи ребенка с пиелонефритом. Параллельный анализ той же пробы мочи культуральным методом выявил E.coli. Если вместе с 3h14 присутствует 3-гидрокси-пальмитиновая (3h16) кислота, то эта пара указывает на инфекцию Burkholderia cepacea. Такая комбинация маркеров найдена  у пяти пациентов с муковисцидозом (N=35), а это очень важно, так как своевременное обнаружение этого микроба позволяет избежать летального исхода, частого при инфекции B. cepacea. Метод комбинации маркеров широко использован при разработке алгоритма реконструкции микробного сообщества по маркерам в биологических жидкостях.
Для видов Bacteroides, Flavobacterium, Cytophaga характерны разветвленные гидрокси-кислоты с 15 и 17 атомами углерода. В одном из первых анализов методом ГХ-МС в 1991 в эякуляте больного орхитом на селективной хроматограмме были обнаружены три четких пика гидрокси-изо-гептадекановой кислоты (3hi17), ее антеизо-варианта (3ha17) и прямоцепочечного аналога 3h17, относящихся к B. fragilis. Лечение метронидазолом сняло симптомы  заболевания, а повторный ГХ-МС анализ показал отсутствие маркеров возбудителя в эякуляте.
Редким маркером является 3-гидрокси-изотридекановая кислота (3hi13), которая содержится в ЛПС Stenotrophomonas maltophila. При культивировании этот микроб часто обнаруживается при санитарно-бактериологическом контроле помещений и оборудования, реже и в малой численности в культуре крови. Методом  ГХ-МС он найден в одном из 35 анализов мокроты при муковисцидозе, а в крови из сотен анализов маркер 3hi13 обнаружен лишь у пациента с редкой болезнью Рейно.
Наряду с 3-оксикислотами у некоторых организмов встречаются и 2-гидрокси-кислоты. которые содержатся в сфинголипидах. Это собственно сфингобактерии (Sphingobacterium), а также различные псевдомонады, виды Acinetobacter, Burkholderia, Alcaligenes и другие (табл. 1). Имеются единичные случаи необычных оксикислот: это изо-2,3-дигидрокси-стеариновая кислота у видов Legionella [19]. Длинноцепочечные оксикислоты 3h20, 3h22 и 3hi20 характерны для Chlamidia trachomatis [20]. Они обнаруживаются в генитальных пробах или глазном отделяемом. Серия высших оксикислот 3h20-3h25 найдена в липопептиде Nocardia rubra [21]. Разнообразие оксикислот грамотрицательных микроорганизмов позволило построить их систематику [22].
Альдегиды плазмологена. В цитоплазматических мембранах некоторых микроорганизмов гидроксилы глицерина этерифицированы, наряду с остатками жирных кислот (ацил- радикалами), еще и алк-1-енил-радикалами жирных альдегидов. Такие глицерофосфолипиды называются плазмологенами. Они присущи в основном клеткам высших организмов, обнаруживаются в форменных элементах крови, сперме, миелине, клетках сердца, мозга и нервной ткани.
Специфические жирные альдегиды дают большую группу маркерных веществ, существенно повышающих специфичность хемодифференциации микроорганизмов. Их удобство в практическом использовании связано также с тем, что они извлекаются из липидов в процессе получения метиловых эфиров жирных кислот при кислом метанолизе. Альдегиды при этом трансформируются в диметилацетали (ДМА).
По разнообразию изомерных и ненасыщенных вариантов альдегиды повторяют номенклатуру жирных кислот. В разных организмах встречаются простые линейные, разветвленные и мононенасыщенные альдегиды с длиной цепи 14-18 атомов углерода. Не обнаружены только гидрокси-альдегиды. Кроме того, альдегиды присущи только грамположительным бактериям.
Ряд работ, уже этого, 21-го века раскрывает важное значение плазмалогена в физиологии организма человека. Плазмалоген играет протективную роль в окислении полиненасыщенных ЖК, управлении выброса холестерина из клеток. Его продукция существенно снижена у больных с синдромом Zellweger, Refsum disease и другими неврологическими заболеваниями. Деменция и общее старение организма сопровождается снижением уровня плазмалогена. В плазмалогене человека одна из жирных кислот в глицериде замещена на 1-алк-енил остаток альдегида С16 или С18. Соответственно, в крови из жирных альдегидов наибольшую концентрацию, около 60 мкг/мл, имеют пальмитиновый и стеариновый. У микроорганизмов кишечника человека и рубца жвачных животных более широкое разнообразие альдегидов, включающее ненасыщенные и разветвленные формы молекул. Оказалось, что в пробах крови в концентрации  до 10 мкг/мл обнаруживается 9-октадеценовый альдегид (18:1Δ9а), содержащийся в клетках эубактерий и бифидобактерий. Следующими по величине альдегидами оказываются 11-октадеценовый (18:1Δ11а) (группа микробов  рода Eubacterium и Clostridium coccoides) и изо-гептадекановый (i17a) (группа видов Propionibacterium и C. subterminale). Eubacterium – родственные клостридиям микроорганизмы, являющиеся одними из основных обитателей кишечника; условные патогены с развитой системой видов и штаммов с универсальными свойствами. Эубактерии участвуют в качестве основных агентов во многих воспалительных процессах и синдромах: воспаления неизвестной этиологии, себорея, атопический дерматит, кахексия, воспаление кишечника, глютеновая энтеропатия, воспаление десен, средиземноморская семейная лихорадка, Yang Xiao-xia’s “mysteriuos disease”, синдром раздраженного кишечника, воспаление легких, бактеремия, хронический синусит, болезнь Крона, периодонтит, артрит, простатит, муковисцидоз, эндометрит, эндокардит, неспецифический вагинит, врожденный порок сердца и другие. Основными функциями эубактерий в организме человека являются: образование водорода, высвобождение гистамина, биотрансформация желчных кислот, индуцирование продукции провоспалительных цитокинов и TNF-alfa, а также противовоспалительного цитокина IL-10 (как ЛПС или клеточные токсины Грам+ патогенов).
Бактериальное происхождение в крови имеют многочисленные простые разветвленные и ненасыщенные ЖК, из которых выделяются 11-октадеценовая кислота. Несмотря на то, что она содержится в клетках неопределенно большого числа видов микроорганизмов, в организме человека ее основным продуцентом являются лактобациллы кишечника.  В анализах крови на дисбактериоз пациентов с рассеянным склерозом  выявлен драматический дефицит маркера лактобацилл (до 100 раз по сравнению с нормой) при одновременном избыточном росте маркера бифидобактерий. В десяти случаях из двадцати в наших наблюдениях за критическими больными в ОРИТ преимущественный количественный прирост обнаруживают лактобациллы. Действительно, по литературным данным они зафиксированы как возбудители при эндокардите, бактериемии, бактериурии, перитонитах, абсцессах и менингитах. Наиболее часто выявляются L. casei и L. rhamnosus [23] Cannon J.P, 2005. Lactobacillus spp. были изолированы также из нарывов, при пневмонии, бактериемии и коньюктивитах.  Факторами патогенности лактобацилл считают продуцируемые ими гликозидазы и протеазы.
Замечено, что мононенасыщенные ЖК специфичны для клостридий. Наиболее важной для клинической диагностики оказалась 7-гексадеценовая кислота (16:1 ω9), найденная в клетках по крайней мере 10 видов клостридий: Clostridium ramosum, C. sordelii, C. septicum, C. subterminale, C. fallax, C. difficile, C. paraputrificum, C. celatum, C. cochlearum, C. limosum. Это вещество отсутствует в ключевых клетках человека. Экспериментальным подтверждением тому является исследование ЖК-состава фосфолипидов эритроцитов [24] [Alexander,1985], в котором фосфолипиды были предварительно препаративно выделены, а затем исследован их жирнокислотный состав. Оказалось, что чистые фракции фосфолипидов эритроцитов содержат только прямоцепочечные четные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты вплоть до уровня 0,01%. Этот вывод можно распространить и на другие форменные элементы крови, поскольку они происходят  из одного источника синтеза — стволовых клеток. 7-гексадеценовая кислота отсутствует также в химическом фоне аналитической процедуры, но встречается  у бактерий рода Streptococcus и метилотрофных бактерий сем. Methylomonadaceae. Однако у последних в профиле липидных компонент отсутствуют альдегиды, характерные для клостридий, что позволяет в целом в алгоритме анализа избежать перекрестных определений.
В анализах клинического материала маркер 16:1 ω9 бывает доминантным в биологических жидкостях, бедных клеточным материалом организма-хозяина. Это моча и ликвор. На диаграмме рис. 2 показан результат реконструкции состава микроорганизмов по микробным маркерам в моче ребенка, 11 лет, больного пиелонефритом. Здесь этот маркер, приписываемый группе C. ramosum, имеет 30-кратное превышение нормы и на порядок выше маркеров других участников инфекционного процесса – клостридий других видов и актинобактерий родов Rhodococcus, Pseudonocardia и других. В этом случае можно ожидать совпадения распределения концентраций ЖК предполагаемого микроорганизма с профилем чистой лабораторной культуры.
 
 

Рис 2. Реконструкции состава микроорганизмов по микробным маркерам в моче ребенка, 11 лет, больного пиелонефритом
 
Действительно, сопоставление распределения ключевых ЖК клостридий C. ramosum с их  соотношением в моче ребенка показывает совпадение профилей с коэффициентом корелляции 0,645 по алгоритму идентификации микроорганизмов по составу ЖК (Microbial Identification System, MIDI Inc., Delaware), что означает совпадение на видовом уровне.
Рис.3. Сопоставление распределения ключевых маркеров клостридий C. ramosum с их  соотношением в моче ребенка. Приведена общепринятая аббревиатура жирных кислот и альдегидов (табл 1). Последние отмечены буквой а в конце символа.
 
Еще одним, редким для микробов веществом является додекановая кислота, которая в группе клостридий Clostridium perfringens, С. putrefacience, C. hystolyticum, C. tetani составляет до 17%  от суммы всех жирных кислот клеточной мембраны. Примечательно, что она обнаружена в крови пациента с аутизмом, что соответствует предполагаемой связи этого заболевания с инфекцией столбнячным микробом C. tetani [25], Clostridium bolteae и другими кишечными микробами [26].
В отличие от клеток человека половина царства прокариот синтезирует разветвленные ЖК [27], причем подавляющее большинство из них имеют в составе мембраны только нечетные разветвленные кислоты. Это стафилококки, виды Butirivibrio, Bacillus, Prevotella, Propionibacterium, Corinebacterium, Bacteroides, Nocardia и другие. Четные разветвленные кислоты из микроорганизмов клинического значения синтезируют представители небольшого числа родов, в том числе стафилококки, виды Streptomyces, Bacteroides, Corinebacterium. Наряду с ними в программу скрининга включены маркеры группы актинобактерий — 10-метилразветвленные кислоты с числом атомов углерода  от 14 до 18, в том числе туберкулостеариновая кислота – маркер микобактерий туберкулеза, изо-пальмитиновая кислота (Streptomyces), 9-транс-гексадеценовая (Nocardia asteroids) и другие. Их мониторинг в клиническом материале (кровь, моча, ликвор, слюна, мокрота, вагинальное содержимое, эякулят, биоптаты кишечника, ткань клапана сердца, атеросклеротические бляшки) обнаружил присутствие этих маркеров в норме, увеличение их концентрации в патологии, ответ на адекватную антибиотикотерапию, что еще раз подтверждает колонизацию организма человека актиномицетами и их участие в микст-инфекции. Актиномицеты относятся к трудно диагностируемым методами традиционной клинической диагностики микроорганизмам и поэтому редко фигурируют в качестве агентов инфекции или воспаления. Тем не менее они являются участниками многих воспалительных процессов в организме человека. Российскими учеными-медиками [28-30] был опубликован ряд научных работ по актиномикозу желудочно-кишечного тракта, ротовой полости, респираторных органов, женских половых органов и пр. С актиномицетами связаны такие серьезные заболевания, как туберкулез, нокардиозы и актиномикозы. Более поздние результаты обобщения Отделения микозов Центра по контролю заболеваний в Атланте (США), подтверждают участие актиномицетов родов Streptomyces, Nocardia, Actinomadura, Rhodococcus, Nocardiopsis, Pseudonocardia и других при респираторных заболеваниях, эндокардите, уретрите а также при раневых и травматических инфекциях [31,32]. Аналогично примеру с C. ramosum нами показано совпадение профиля ЖК отделяемого перикарда, у пациента с перикардитом, профилю чистой культуры актинобактерии Streptomyces albus. По данным Центра по контролю заболеваний США, около 10% проб изолятов актиномицетов, поступающих в Центр, идентифицируют как Streptomyces. Известны также случаи респираторных заболеваний, связанные с представителями этого рода,  а также случай выявления Streptomyces в качестве инфекционного агента при эндокардите. По данным Центра стрептомицеты чувствительны только к амикацину [31]. Только после назначения амикацина пациент с доминирующей инфекцией  S. albus был выведен из септического состояния.
В состав липидов многих бактерий входят уникальные жирные кислоты – циклопропановые, образующиеся из мононенасыщенных жирных кислот. Циклопропановые жирные кислоты имеют цис— конфигурацию. Для бактерий видов Lactobacillus, Pseudomonas, Brucella, Helicobacter и других характерна цис –11,12-метиленоктадекановая (лактобацилловая) кислота, происходящая из цис-вакценовой кислоты и цис-9,10-метиленгексадекановая кислота у представителей сем. Enterobacteriaceae (маркер семейства).
Специфическим признаком дрожжей (дрожжеподобных грибов) Candida в липидной фракции биологических жидкостей человека является гептадеценовая кислота 17:1 [33]. Она обнаружена нами в чистых культурах C.albicans и других видов рода, а также у пациенток с вагинальным кандидозом [34].
Как оказалось, истинные грибы – плесневые, дерматофиты и другие можно детектировать по их стеринам, прежде всего – эргостеролу, который считается грибным стерином, в отличие от холестерола, стерина животных и ситостерола – стерина растений. Оказывается, ситостерол могут продуцировать и грибы. Кроме того, они синтезируют также кампестерол. Эти вещества включены в программу МСММ. Кроме того, включены длинноцепочечные 2-гидрокси-кислоты с числом атомов углерода 22-26, которые обнаружены нами в чистых культурах микроскопических грибов и дрожжей, патогенных для человека, а также в клиническом материале.
У детей с инфекционным мононуклеозом, в отличие от других респираторных патологий обнаружено в динамике десятикратное увеличение концентрации гидрокси-эргостенила — производного холестерина, что нами логично ассоциировано с метаболическим действием вируса Эпштейна-Барр, известного микробного агента этого заболевания. Оказалось, что появление этого метаболита в крови пациентов связано также с синдромом хронической усталости, одной из причин которого так же предполагается вирусная инфекция [35].
На основании этих анализов методом МСММ расшифрован состав микробиоты  пристеночного мукозного слоя отделов кишечника, а также фекалий [36,37]. Данные по фекалиям оказались в полном количественном соответствии с литературными, что послужило основанием для подтверждения достоверности данных, получаемых методом МСММ. Одновременное исследование биоптатов кишечника и крови пациентов, а также доноров показало соответствие состава минорных ЖК, альдегидов и стеролов в тонкой кишке и в крови. Показана количественная адекватность изменений их концентраций в этих органах при дисбактериозе, ассоциированном с синдромом раздраженной тонкой кишки с преобладанием поносов, болезнью Крона и псориазом [36, 37]. Это означает возможность неинвазивной оценки изменений микрофлоры кишечника по данным анализа крови методом ГХ-МС микробных маркеров.
Таблица 1
Высшие жирные кислоты альдегиды и стерины в составе клеточной стенки с отнесением к микроорганизмам, у которых они наиболее часто встречаются
 

* — Обозначения веществ: 17:1 — 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия — число двойных связей; h — оксикислота; а,i — в начале означает разветвление; cyc — циклопропановая кислота. Например, ha17 — 3-окси-антеизогептадекановая кислота.
**- имеется в виду 3-оксикислоты, если не указано положение гидроксила
 
Выбор антибиотиков при лечении по данным масс-спектрометрии микробных маркеров имеет свои особенности. По опыту предыдущих и настоящих исследований надо отметить, что отнесение дисбиоза за счет антибиотикотерапии  следует рассматривать во вторую очередь, отдавая предпочтение другим стрессовым факторам. Самым красноречивым подтверждением в  этом плане является опыт по воздействию экстремальных доз ампициллина на микробиоту крыс. Она (микробиота) оказалась устойчивой к этому препарату [38]. Так же, как устойчива биопленка к действию антибиотиков in vitro [39]. Молекулярный метод диагностики инфекции и дисбиозов не требует выделения микробов в чистой культуре – это его преимущество [40]. Оно имеет свою отрицательную сторону. Нельзя определить привычную для врача чувствительность к антибиотикам штаммов микроорганизмов, выделенных от данного больного. Но ведь метод определяет по большей части некультивируемые микроорганизмы – значит это естественный недостаток. Его преимущество – обнаружение в количественном измерении реально действующих микроорганизмов инфекционного процесса – стоит большего. Кроме того, после первого назначения АБТ этот недостаток снова обращается в преимущество, когда при повторном анализе методом МСММ выявляют реальное, in vivo, действие первичной терапии по убыванию маркеров агентов инфекции, а также выявляют толерантную составляющую полимикробной инфекции и обнаруживают микробные агенты конкурентной (оппортунистической) микробиоты.  Данные по чувствительности надо брать из литературы. Все «некультивируемые» микроорганизмы на самом деле когда-то были выделены в чистом виде, описаны по всем правилам микробной таксономии и опубликованы в научной литературе. Они оперативно доступны через сеть Интернет.
 
Благодарность. Авторы выражают глубокую признательность Руководителю Отдела лабораторной диагностики НИИ скорой помощи им Н.В.Склифосовского, доктору медицинских наук Годкову Михаилу Андреевичу за прочтение статьи и ценные замечания, которые с благодарностью приняты в ее окончательной редакции.
 
 
 
 
 
 
Научные руководители:
Кириллова Надежда Васильевна, профессор,  доктор биологических наук, заведующая кафедрой биохимии, Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия.
 
_______________/_________________________/
 
Родионов Геннадий Георгиевич, доцент, доктор медицинских наук, врач клинической лабораторной диагностики, заведующий лабораторией токсикологии и лекарственного мониторинга, ФГБУ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М.Никифорова.
 
_______________/________________________/