Опыт применения масс‑спектрометрии микробных маркеров в лабораторной диагностике

Г. А. Осипов 1, д. м. н., проф.
Н. Н. Зыбина 2, д. б. н., проф., зав. отделом
Г. Г. Родионов 2, д. б. н., доцент, зав. лабораторией токсикологии и лекарственного мониторинга
 
1 Академическая группа академика Ю. Ф. Исакова при Научном центре сердечно‑сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН, г. Москва
2 Отдел лабораторной диагностики ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А. М. Никифорова» МЧС России, г. Москва
 
Experience of Using Mass Spectrometry of Microbe Markers in Laboratory Diagnostics

1. A. Osipov, N. N. Zybina, G.G Rodionov

Резюме
Метод газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ–МС) — позволяет одновременно измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале:  крови, моче, биоптатах и других биологических жидкостях и тканях, минуя стадии предварительного посева на питательные среды или использование тестовых биохимических материалов. Автомати- ческий алгоритм анализа с помощью штатных программ ГХ–МС позволяет определить численность более 57 клинически значимых видов микроорганизмов в материале в течение трех часов с момента его поступления в лабораторию.
Ключевые слова: газовая хроматография, масс-спектрометрия, микробные маркеры, микробиота, дисбиоз.
 
Summary
Gas chromatography — mass spectrometry (GC–МS) — makes it possible to measure at one time concentra- tions of more than a hundred microbe markers directly in the analyzed material — blood, urine, bioptates and other biological liquids and tissues — without the stages of preparatory seeding of media or using test bio- chemical materials. Automatic analysis algorithm using standard programs of GC–MS allows determining the abundance of more than 57 clinically significant types of microorganisms in the material over three hours from the moment of its receipt by the laboratory.
Keywords: gas chromatography, mass spectrometry, microbe markers, microbiota, dysbiosis.

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров разработан в России и уже более 20 лет исполь- зуется для количественного анализа таксономического (родового или видового) состава микробных сообществ в медицине [1]. В его основе лежит высокоточное определение присутствия молекулярных признаков микроорганизмов (маркеров) из числа их клеточных липидов — высших жирных кислот, альдегидов, спир- тов и стеролов в анализируемой пробе (рис. 1). Данный метод сходен с молекулярно-генетическим анализом, например, ПЦР определение последовательности нуклеотидов 16s-рРНК и пр.

Определение производится  высокочувствительным и селективным методом газовой хроматографии — масс спектрометрии (ГХ–МС), позволяющим одновременно измерять более сотни микробных маркеров непосредствен- но в анализируемом материале, крови, моче, биоптатах, пунктатах, мокроте, и других биологических жидкостях и тканях без предварительного посева на питательные среды или использования тестовых биохимических ма- териалов. Разработанный автоматический алгоритм ана- лиза с помощью штатных программ ГХ–МС, позволяет

Рис. 1. Состав клеточной мембраны микроорганизмов.
 
определить концентрацию более 57  микроорганизмов в материале через три часа после его поступления в лабо- раторию (рис. 2). Он отличается от зарубежных прототипов применением режима селективных ионов вместо полного сканирования масс-спектра и введением вместо одного сра
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
Рис. 2. Селективные хроматограммы жирных кислот (ион 87, верхний рисунок), жирных альдегидов (ион 75, рисунок в середине) и гидрок‑ си‑кислот (ион 175, нижний рисунок), экстрагированных из клинического материала, содержащего микроорганизмы и (или) их маркеры.
 
 
зу 150 маркеров, перекрывающих все установленное в на- стоящее время многообразие микроорганизмов в природе. В 2010 году Росздравнадзором разрешено применение ука- занного метода в качестве новой медицинской технологии
«Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).
За последние два десятилетия по различным про- граммам федерального уровня многие лечебно-профи- лактические учреждения, медицинские центры и уни- верситеты России были оснащены системами ГХ–МС таких фирм, как Agilent Technologies (США), Shimadzu (Япония) и Thermo (Finnigan). В отдел лабораторной диагностики ФГБУ «Всероссийский центр  экстренной и радиационной медицины им. А. М. Никифорова» МЧС России (рис. 3) был поставлен газовый хроматограф Agilent 7890 с масс-селективным Agilent 5975 С и пла- менно-ионизационным детекторами (Agilent Technologies, США). Разработанный в России метод ГХ–МС [2, 3] дает возможности реализации данного оборудования в нашем учреждении для рутинного клинического бактериологиче- ского анализа и мониторинга в реальном времени наряду и в дополнение к другим микробиологическим анали- заторам, но с преимуществами по ряду принципиально важных параметров диагностики.
 
Методу ГХ–МС микробных маркеров присущи сле- дующие характеристики [4]:

• широкий диагностический спектр (определение мар- керов десятков микроорганизмов одновременно в од- номанализе);

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рис. 3. Газовый хроматограф Agilent 7890 с масс‑селективным Agilent 5975 С и пламенно‑ионизационным детекторами (Agilent Technologies, США).

• универсальность (определение разных групп микро- организмов: бактерий, грибов,вирусов);
• экспрессность(время одного анализа не более трех часов);
• высокая чувствительность (0,01 нг/млмаркера);
• селективность (определение микроорганизма до вида при наличии видовогомаркера);
• независимость от оснащения микробиологической лаборатории и возможность прямого анализа клини- ческих образцов без высевания иподращивания;
• экономичность (метод не  требует  биологических и биохимических тестовых материалов, культураль- ных сред, ферментов, олигонуклеотидныхпраймеров).

 
Обнаруженный в результате систематических ис- следований гомеостаз микробных маркеров  в  крови и адекватность его профиля составу кишечной микро-
 
 
 
флоры здорового человека обеспе- чил уникальную возможность мони- торировать состояние микробиоты кишечника экспрессным методом по анализу крови [5].
Одним из последствий стрессовых воздействий на организм человека является нарушение, порой устойчи- вое, обмена веществ как следствие изменений микрофлоры кишечника и ассоциированной с ними проницае- мости кишечной стенки. В результате возникает диспропорция в поступле- нии биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, в организм человека и нарушение его нормального функционирования. Последствия могут быть тяжелыми (не обязательно патологическими), поскольку от микробиоты кишечной стенки зависит продукция более поло- вины необходимых для человека вита- минов, ферментов, факторов, сигналь- ных молекул, медиаторов и других со- единений, требуемых для обеспечения метаболизма и репродукции его соб- ственных клеток и систем: иммунной, нервной, эндокринной и других. Счи- тается, что именно микроэкологиче- ские изменения в организме человека являются запускающим механизмом подавляющего большинства патоло- гических процессов, и существует столько вариантов дисбаланса микро- биоценозов человека, сколько извест- но нозологических форм заболеваний [6]. На рубеже ХХI века сформиро- валось представление о микрофлоре организма человека как о еще одном
«органе», который насчитывает поряд- ка 1014 клеток (сто биллионов) клеток микроорганизмов, что в десять раз превышает число собственных клеток организма-хозяина [5, 6]. Поэтому микроэкологический статус человека, точнее, поддержание его гомеостаза, является необходимым условием ста- бильного функционирования всех его органов и систем. Соответственно, од- ним из первых этапов в реабилитации людей, переживающих экстремальные ситуации в силу особенностей своих профессий, должен быть контроль и восстановление микробиоценоза, если он оказался нарушенным.
Нами были обследованы 110 прак- тически здоровых медицинских работ- ников ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова (60 женщин и 50 мужчин) среднего
возраста 30–50 лет. Для анализа цель- ную кровь с ЭДТА в количестве 40 мкл пипеткой переносили в виал (емко- стью 1,5 мл с завинчивающейся крыш- кой с тефлонированной прокладкой), подсушивали (при снятой крышке) в термостате при 80 °C с добавлением 40 мкл метанола для ускорения суш- ки. К загустевшей пробе приливали 400 мкл 1 М соляной кислоты в метано- ле, завинчивали плотно крышкой и под- вергали кислому метанолизу при 80 °C в течение одного часа. К охлажденной реакционной среде добавляли 300 нг стандарта (дейтерометиловый эфир тридекановой кислоты), растворенного в гексане. Затем проводили экстракцию двумя порциями по 200 мкл гексана, встряхивая смесь на вортексе и позво- ляя ей отстоятся в течение 5 мин. при комнатной температуре. Объединен- ный экстракт переносили в чистый виал, высушивали 5–7 мин. при 80 °C и сухой остаток обрабатывали 20 мкл N, О-бис (триметилсилил)-трифтора- цетамида, в течение 15 мин. при 80 °C при закрытой крышке. К реакционной смеси добавляли 80 мкл гексана и при анализе с использованием автосам- плера переносили смесь в коническую вставку, которую помещали в тот же виал, в котором проводили силили- рование, и завинчивали его плотно крышкой. В таком виде проба пригодна для анализа в течение недели, если она герметично закрыта и не происходит ее испарения.
 
При обследовании выявлены сле- дующие типы изменений нормаль- ной микробиоты организма:

• избыточный рост микроорганиз- мов, общий иличастичный;
• сниженный рост микроорганиз- мов, общий иличастичный;
• разнополярные изменения отдель- ных составляющихмикробиоты.

 
Эти изменения соответствен- но адекватны изменению пула хи- мических веществ, поступающих к человеку от микробиоты. У 90 % обследованных, независимо от пола и возраста, в крови установлены концентрации выше нормы таких маркеров, как Peptostreptococcus an- aerobius, Streptomyces, Clostridium hystolyticum, Clostridium ramosum, сем. Enterobacteriaceae (E.coli и пр),
Prevotella, Ruminicoccus, Propioni- bacterium jensenii, Campylobacter mu- cosalis, Nocardia asteroides на фоне дефицита (порой двукратного):

• лактобактерий, эубактерий, бифи- добактерий ипропионобактерий;
• эубактерий, бифидобактерий ипропионобактерий;
• бифидобактерий и пропионобак- терий.

 
При этом чаще всего наблюдалось снижение общего количества микро- бов (на 30–50 %), а также бифидобак- терий и пропионобактерий, что ука- зывает на развитие дисбиотического состояния у обследованных лиц.
Необходимо отметить и то об- стоятельство, что состав доминант- ных родов и групп микроорганизмов из микробоценоза жителей г. Москвы, измеренных по микробным марке- рам в крови, отличается по некото- рым позициям от состава обследо- ванных жителей г. Санкт-Петербурга. Так, было обнаружено, что у жите- лей г. Санкт-Петербурга количество Eubacterium lentum (группа А) было увеличено до 196 × 10 5 (в два раза), Propioniobacterium jensenii до 150 × 105 (в два раза), Ruminicoccus до 1110 × 105 (в 1,5–2 раза), Nocardia asteroides до 500 × 10 5 (в 1,5–2 раза), герпеса
до 1 500 × 105 (в 15–20 раз), цитоме-
галовируса до 480 × 105 (в 2–2,5 раза). Использование метода ГХ–МС по- зволило установить снижение ко- личества Lactobacillus до 2 400 × 105 (в 2–2,5 раза), Propioniobacteri- um/Cl.subterminale до 1 400 × 105 (в три раза), Bifidobacterium до 3 000 × 105 (в 1,7 раза). Полученные данные под- тверждают концепцию о том, что нор- мальная микробиота выступает как чуткий индикатор физиологического состояния макроорганизма в зависи- мости от воздействия на него различ- ных факторов, в том числе и условий проживания человека в мегаполисах.
Поддержание относительно ста- бильного качественного и количе- ственного состава микробиоценоза человека имеет важное значение  в обеспечении нормального фи- зиологического статуса организ- ма. С современных позиций нор- мальную микробиоту человека рассматривают как совокупность микробных сообществ локусов, ха-
 
 
 
рактеризующихся определенным составом и колонизирующих кожу и слизистые оболочки. Эти сооб- щества состоят из десятков и сотен родов и видов микроорганизмов. В процессе эволюции постоянные представители нормальной микро- биоты превращались во все более взаимосвязанное сообщество ми- кроорганизмов, находящихся между собой и организмом хозяина в разно- образных взаимоотношениях (ней- трализм, конкуренция, мутуализм, комменсализм, синергизм, парази- тизм, синтрофия и др.) с разделе- нием и специализацией их функций. Подобная интеграция и специализа- ция функций позволяет нормальной микробиоте здорового человека вы- ступать как единое целое, согласо- ванно работающее в интересах всей системы организма, в котором она локализована. Нормальная микро- биота — тот первичный неспецифи- ческий барьер, лишь после прорыва которого инициируется включение
всех последующих неспецифиче- ских и специфических факторов защиты макроорганизма.
Метод масс-спектрометрии ми- кробных маркеров, благодаря своей экспрессности и информативности, позволяет получать данные, под- тверждающие связь ряда заболеваний с изменением микроэкологического статуса организма. Для практическо- го врача это означает возможность усовершенствования тактики лечения больных за счет выбора этиотропных антибиотиков для подавления из- быточного роста части микробиоты и стимулирования размножения де- фицитной группы микробов, с при- менением жидких пробиотиков типа нормофлоринов или биовестинов.
 
Список литературы

1. Осипов Г. А. Способ определения родо- вого (видового) состава ассоциации ми- кроорганизмов.//Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1/4. Приоритет от 24 дек.1993 г. Зарегистрировано в гос. реестре08.97.‑ Бюл. № 22.
2. Осипов Г. А. Шабанова Е. А. Недорезо- ва Т. П. Истратов В. Г. Сергеева Т. И. Спо- соб диагностики клостридиальной анаэ- робной газовой инфекции. ПатентРФ

№ 2021608 кл. G01N 33/50.‑ Зарегистри— ровано в гос. реестре 15.10.94.‑ Бюл. № 19.

3. Осипов Г. А., Белобородова Н. В. Патент на изобретение № 2146368 «Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма», Патент заре- гистрирован в Госреестре изобретений РФ 10.03 2000 г. — Бюл. №
4. Осипов,Г. А. Хромато‑масс‑спектроме- трический анализ микроорганизмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах./Химический анализ в медицинской диагностике.‑ М.: Наука, ‑ С. 293–368.
5. Осипов Г. А., Парфенов А. И., Верхов- цева Н. В., Ручкина И. Н., Курчавов В. А., Бойко Н. Б., Рогатина Е. Л. Клиническое значение исследования микроорга- низмов слизистой оболочки кишечника культурально‑биохимическими хрома— то‑масс‑спектрометрическим метода— ми. Эксп. Клин. Гастроэнтерология, 2003; (4): С. 59–67.
6. Шендеров Б. А. Медицинская микроб- ная экология и функциональное пита- ние. В 3‑х томах. Том 1.; Микрофлора человека и животных и ее функции. М., Грант, 1998; С.14–17.