Микроэкологический статус кандидатов на пересадку печени

  • Главная
  • Статьи

Андрейцева О.И.1, Киселев В.В.1, Бойко Н.Б.2, Осипов Г.А.2, Федосова Н.Ф.3, Лядов К.В.3
 
Микроэкологический статус кандидатов на пересадку печени
 
1НИИ   скорой помощи им Н.В. Склифосовского
2Академическая группа Академика РАМН Ю.Ф.Исакова (при НЦ ССХ им А.Н.Бакулева)
3Лечебно-реабилитационный центр Минздрава
 
Автор для переписки:
Киселев В.В.  – eloim@mail.ru
 
The microecological status of candidates for liver transplantation
V.V. Kiselev1, O.I. Andreitseva1, N.B. Boiko2, G.A. Osipov2, N.F. Fedosova3, K.V. Lyadov3
1N.V. Sklifosovsky Research Institute of Emergency Care, Moscow;
2Acad. of the Russian Academy of Medical Sciences Yu.F. Isakov (A.N. Bakulev Research Center of Cardiovascular Surgery);
3Therapeutic Rehabilitation Center, Russian Agency for Health Care, Moscow
 
A method for identifying mixed infections, dysbioses, and inflammatory processes from specific markers (fatty acids, aldehydes, and sterols) by chromatographic mass spectrometry was used to study the microecological status of patients eligible for liver transplantation. Heterogeneous microorganisms (aerobes, anaerobes, actinobacteria, fungi, and viruses) were quantified from molecular markers in an experiment within 3 hours after the samples were sent to the laboratory. The examinees were found to have excessive growth of gram-positive anaerobes (Clostridia, eubacteria), actinobacteria of the genera Streptomyces, Nocardia, and Candida yeasts. Next were staphylococci, streptococci, and gram-negative microorganisms of the group Moraxella/Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylory, and Fusobacterium/Haemophylus. Antibiotics and probiotics were chosen to correct dysbiosis and infection, by taking into account the data available in the literature. The speed and accuracy of the procedure ensure real-time monitoring of a treatment process under control of mass spectrometry.
 
Key words: liver transplantation, microecology, dysbacteriosis, gas chromatography, mass spectrometry, fatty acids, microbial markers, anaerobic infection, Clostridia, eubacteria
Резюме
 
Метод определения микст-инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим маркерам (жирным кислотам, альдегидам и стеролам) с помощью хромато-масс-спектрометрии применен для исследования микроэкологического статуса больных – кандидатов на пересадку печени. В одном опыте количественно определены разнородные микроорганизмы (аэробы, анаэробы, актинобактерии, грибы, вирусы) по молекулярным маркерам в крови в течение трех часов с момента его поступления в лабораторию. Найдено, что избыточный рост у обследованных наиболее часто обнаруживают грамположительные анаэробы (клостридии, эубактерии), актинобактерии родов Streptomyces, Nocardia и дрожжи Candida.  Далее по ранжиру следуют стафилококки, стрептококки и грамотрицательные микроорганизмы группы Moraxella/Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter pylori и Fusobacterium/Haemophylus. Выбор антибиотиков и пробиотиков для коррекции дисбиоза и инфекции производили по литературным данным. Экспрессность и точность методики обеспечивает оперативный мониторинг процесса лечения под контролем масс-спектрометрии.
 
Ключевые слова. Трансплантация печени, микроэкология, дисбактериоз газовая хроматография, масс-спектрометрия, жирные кислоты, микробные маркеры, анаэробная инфекция, клостридии, эубактерии
 
Введение
 
Одним из последствий стрессовых воздействий на организм человека является нарушение, порой устойчивое, обмена веществ в организме как следствие изменений микрофлоры кишечника и ассоциированной с ними проницаемости кишечной стенки. В результате возникает диспропорция в поступлении биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, в организм хозяина и нарушение нормального функционирования его органов. Последствия могут быть патологическими, поскольку от микробиоты кишечной стенки зависит продукция более половины необходимых для человека витаминов, ферментов, факторов, сигнальных молекул, медиаторов и других гормоноподобных соединений, требуемых для обеспечения метаболизма и  репродукции его собственных клеток и систем – иммунной, нервной, эндокринной и других. Пептидогликан клеточных стенок грамположительных микроорганизмов (они составляют абсолютное большинство пристеночной микробиоты кишечника человека) активно участвует в регуляции иммунного статуса хозяина на местном и системном уровнях. Считается, что именно микроэкологические изменения в организме хозяина являются запускающим механизмом подавляющего большинства патологических процессов, и существует столько вариантов дисбаланса микробиоценозов человека, сколько известно нозологических форм заболеваний [10].
Поэтому микроэкологический статус человека, точнее, поддержание его гомеостаза, является необходимым условием стабильного функционирования всех его органов и систем. Соответственно, одним из первых этапов в реабилитации людей, переживающих стресс при серьезном хирургическом вмешательстве, коим является трансплантация органов, должен быть контроль и восстановление микробиоценоза, если он оказался нарушенным.
Если учесть, что микробиота человека преимущественно состоит из анаэробов, то очевидно, что решением перечисленных выше проблем является учет анаэробов в этиологии дисбактериоза и инфекции с соответствующей модификацией антибиотикотерапии и коррекции микробиоты пробиотиками [2, 9].
Новое направление в молекулярной  микробной диагностике – определение микст-инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим маркерам (жирным кислотам, альдегидам и стеролам) с помощью хромато-масс-спектрометрии позволяет быстро и надежно определять малые доли веществ микробного происхождения в любых биологических средах организма человека. Этот метод микробиологического исследования быстр и универсален, поскольку не требует выращивания отдельных микроорганизмов на специальных средах и проведения для каждого из них специальных биохимических тестов для определения вида возбудителя [6, 8]. Точное количественное определение микроорганизмов способствует назначению целенаправленной антибактериальной терапии и оперативному контролю ее эффективности. Метод масс-спектрометрии, в отличие от применяемого в обычной практике посева клинического материала на культуральные среды, дает информацию о «замаскированной» части микст-инфекции, состоящей из некультивируемых в условиях лабораторий клинической микробиологии микроорганизмов.
Обнаруженный в результате систематических исследований гомеостаз микробных маркеров в крови [1, 12]  и адекватность его профиля составу кишечной микробиоты здорового человека обеспечил уникальную возможность мониторировать состояние микробиоты кишечника неинвазивным экспрессным методом – по анализу крови [7]. Поскольку в кровь попадают также липидные компоненты отмирающих микроорганизмов из других органов, то его можно считать экспрессным методом определения микроэкологического статуса высших организмов.
Целью настоящего исследования является попытка подтвердить и дополнить известные из предыдущих исследований сведения о микроэкологии больных с серьезными заболеваниями печени, а также описать ее становление после  трансплантации с помощью метода масс-спектрометрии микробных маркеров.
 
Методы
Режим анализа подробно описан ранее [6, 8]. Коротко, он состоит в следующем. Кровь в количестве 0,04 мл подвергали кислому метанолизу  в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение одного часа при 80°С. В результате реакции метанолиза жирные кислоты, входящие в состав сложных липидов пробы освобождаются в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 2 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы HP-5973 Аджилент Технолоджис (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Хьюлетт-Паккард. Длина колонки 25м, внутренний диаметр 0.25 мм. Режим анализа — программированный, скорость нагрева термостата колонки — 5 град/мин в диапазоне 130 — 320°С.
Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. Для количественного расчета использовали данные калибровки по дейтерированной тридекановой кислоте и чистым культурам клинических изолятов микроорганизмов.
Ошибка количественных измерений численности микроорганизмов из-за погрешности в подготовке проб и анализа, несоответствия состава жирных кислот чистых культур банка данных и изучаемого сообщества in situ может составлять 20%.
Метод характеризуется следующими показателями:
Определение более 50 микроорганизмов одновременно в одном анализе
Универсальность в отношении разных групп микроорганизмов: бактерии, грибы, вирусы
Время анализа – 2.5 часа
Чувствительность 103-104 клеток в пробе
Селективность – до вида при наличии маркера
Анализ непосредственно в материале без высевания и подращивания
Не требует биологических и биохимических тестовых материалов – культуральных сред, ферментов, тестовых субстратов, праймеров и т.п.
При анализе селективных хроматограмм систематически фиксировали в крови обследованных пациентов (N=41) маркеры 47 таксонов (родов или видов) микроорганизмов, включая некоторые группы грибов и вирусов.
 
Результаты
Результаты измерения концентраций микробных маркеров в крови с последующей реконструкции микробного сообщества позволили определить изменение общего микроэкологического статуса больного, а также состав микст-инфекции в очаге поражения (табл. 1и 1а).
 
 
 
 
 
 
Таблица 1
Результаты анализа микроэкологического статуса пациентов –
кандидатов на пересадку печени  (N=41) в сравнении с нормой.

Микроорганизм Норма кл/г х 10*5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
NT-5554 NT-5678 NT-5688 NT-5753 NT-5772 NT-5779r NT-5788 NT-5794 NT-5807 NT-5817 NT-5818 NT-5820 NT-5821 NT-5826 NT-5827 NT-5828 NT-5829 NT-5830 NT-5836 NT-5844
1 Streptococcus 249 1853 499 107 398 70 937 0 195 282 1315 367 106 0 345 551 408 0 486 310 390
2 Eubacterium lentum 68 174 344 670 387 381 162 316 336 483 497 732 545 577 542 135 414 232 407 167 809
3 Bacillus cereus 23 59 76 25 13 6 36 0 14 20 39 8 45 30 0 28 0 24 28 19 41
4 Peptostreptococcus anaerobius 0 217 366 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 107 0 0 0 0 0
5 Clostridium hystolyticum 95 58 0 20 0 0 67 0 0 19 0 0 0 51 7 39 50 53 13 0 0
6 Nocardia, 14:1d11 262 1393 1450 321 830 308 1307 211 182 519 1526 416 1722 1532 318 579 633 375 1133 54 1119
7 Moraxella/Acinetobacter 0 1 4 6 1 16 0 0 0 12 2 7 4 21 15 0 19 0 2 1 2
8 Pseudomonas aeruginosa 0 2 9 3 6 8 0 5 5 4 4 4 6 0 24 77 5 18 9 5 4
9 Streptomyces 62 309 300 350 368 126 216 127 170 242 463 220 361 283 217 157 139 181 398 57 539
10 Clostridium ramosum 2000 4985 5594 5545 3846 2112 3281 2975 3335 4824 5010 2499 4739 10386 2701 3790 5558 3868 11156 2115 4271
11 Fusobacterium/Haemophylus 0 0 4 5 0 11 1 7 5 0 11 8 11 185 19 7 7 6 7 7 7
12 Alcaligenes 48 17 83 23 0 43 5 38 39 41 45 54 47 108 64 39 29 35 72 59 91
13 Rhodococcus 423 345 375 566 486 576 345 424 484 723 536 589 451 1273 725 409 519 554 609 493 1112
14 Corinebacterium 605 311 456 464 574 230 323 228 270 645 588 319 541 779 290 216 234 292 604 111 718
15 Lactobacillus 6613 2440 5523 7176 7196 4952 2948 6009 6342 7298 8604 5950 6885 16072 4825 4563 5791 6660 13167 5665 10135
16 Campylobacter mucosalis 99 0 345 404 116 632 29 28 27 23 59 60 51 102 63 25 72 29 71 25 75
17 Candida 549 793 2828 254 1102 560 740 371 476 1339 1383 496 1018 1666 439 496 535 386 1515 219 1377
18 Enterobacteriaceae (E.coli и др.) 0 6 0 0 0 0 0 0 0 74 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19 Cl.difficile 385 198 785 85 436 215 215 322 318 404 446 417 436 748 355 252 219 280 385 175 585
20 Prevotella 38 22 102 0 16 0 9 63 56 60 60 61 79 703 69 53 41 50 49 51 86
21 Eubacterium spp 6912 1892 9159 24031 5886 13444 2578 13326 15596 9992 7725 15484 10188 20465 12418 5059 12164 10993 18502 16727 17786
22 Bacteroides fragilis 0 0 19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
23 Staphylococcus 120 237 357 319 354 220 154 165 177 425 374 353 361 630 279 170 223 224 333 114 512
24 Bifidobacterium 5067 1972 2915 8611 1188 3629 1593 7249 278 5883 4166 1104 7786 9787 4825 3539 6266 3209 4221 4846 5982
25 Helicobacter pylori 14 23 74 59 14 28 6 23 40 38 45 50 47 212 59 36 33 39 41 53 55
26 Clostridium perfringens 12 30 77 11 25 15 9 15 16 23 39 26 42 46 19 16 21 16 164 31 39
27 Enterococcus 290 421 2297 144 547 426 207 222 349 418 580 376 601 704 276 300 357 0 0 254 767
28 Eubacterium 59 12 244 0 0 0 3 0 12 14 15 18 0 18 15 7 10 8 13 18 15
29 Propionibacterium spp 4480 1454 3585 7113 6119 4554 1387 3800 4418 5294 5035 5002 4357 5804 7053 2379 4326 1998 3640 1589 5885
30 Streptococcus mutans 229 332 409 676 272 327 103 322 219 550 415 378 322 821 237 339 389 426 710 339 703
31 Herpes 59 7 247 15 0 0 0 0 27 0 15 14 47 60 22 0 12 8 23 41 46
32 Nocardia asteroides 274 329 614 699 582 345 278 482 544 955 861 804 583 1165 530 266 629 401 995 306 592
33 Цитомегаловирус 166 31 88 7 63 13 5 0 25 9 12 15 18 41 490 146 14 10 107 66 26
34 Микр грибы 384 218 814 44 260 168 46 13 138 330 91 879 204 413 142 32 135 247 117 272 1442
35 Ruminicoccus 640 855 1051 1338 1029 544 816 695 559 961 1571 1392 708 3350 518 367 509 713 4187 687 3868
36 Butyrivibrio/Cl. fimetarum 0 75 123 196 0 0 0 0 0 65 0 0 0 0 12 5 0 0 0 0 0
37 Actinomyces viscosus 1190 1731 1003 1159 934 896 255 1184 733 899 1242 1135 1527 2233 791 1125 1164 717 811 545 1205

Данные в размерности [клеток/мл х105]
 
Таблица 1а
Результаты анализа микроэкологического статуса пациентов –
кандидатов на пересадку печени  (N=41) в сравнении с нормой.

Микроорганизм Норма кл/г х 10*5 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
NT-5852 NT-5853 NT-5867 NT-5875 NT-5876 NT-5883 NT-5921 NT-5930 NT-5933к NT-5934 NT-5951 NT-5962 NT-5947 NT-5977 NT-5984 NT-5986 NT-6022 NT-6071 NT-6072 NT-6101 NT-6111
1 Streptococcus 249 288 487 133 165 217 704 493 641 126 196 165 198 1244 117 207 212 208 0 75 176 96
2 Eubacterium lentum 68 454 414 315 295 96 186 171 156 94 111 26 46 147 305 189 345 131 220 311 314 113
3 Bacillus cereus 23 15 14 4 14 16 34 40 20 0 16 3 0 33 0 21 18 31 39 0 69 34
4 Peptostreptococcus anaerobius 0 0 0 0 0 0 0 0 45 0 0 1 0 80 0 0 0 1 0 0 0 0
5 Clostridium hystolyticum 95 0 0 0 0 39 78 21 7 0 24 15 4 7 0 0 0 27 57 0 66 0
6 Nocardia, 14:1d11 262 763 456 1008 548 66 605 1311 905 773 448 567 140 847 307 719 711 1058 694 628 826 181
7 Moraxella/Acinetobacter 0 10 6 7 0 0 26 3 2 2 11 6 5 11 10 8 12 11 4 10 12 0
8 Pseudomonas aeruginosa 0 7 0 8 0 0 13 5 9 4 5 2 3 5 8 5 4 7 0 14 4 0
9 Streptomyces 62 302 211 351 211 346 287 66 201 0 179 74 67 212 167 345 200 172 68 240 455 37
10 Clostridium ramosum 2000 4330 2980 3357 3242 5906 6086 2355 4007 4489 3420 997 1875 1733 2791 4526 3322 3564 2371 2354 8647 2922
11 Fusobacterium/Haemophylus 0 10 5 9 0 1 18 5 7 4 4 0 4 6 9 7 8 9 2 14 13 0
12 Alcaligenes 48 75 49 47 0 0 62 31 41 28 23 14 20 20 46 37 28 48 9 42 52 0
13 Rhodococcus 423 362 385 1389 197 229 692 1060 430 365 776 392 105 262 724 422 1561 426 1080 292 987 324
14 Corinebacterium 605 452 313 560 176 146 427 170 243 112 159 117 75 199 253 298 349 273 241 360 615 168
15 Lactobacillus 6613 5877 4969 6505 4162 4378 5675 4008 3819 6463 5370 2598 1469 1925 4759 6273 4357 4648 6273 4467 8068 3401
16 Campylobacter mucosalis 99 24 26 66 9 34 90 119 15 0 22 17 5 12 28 18 172 30 26 8 80 289
17 Candida 549 785 469 1940 372 719 1116 1269 673 709 497 503 213 381 476 696 1285 615 1150 544 1416 367
18 Enterobacteriaceae (E.coli и др.) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77
19 Cl.difficile 385 440 315 478 199 217 447 315 175 506 134 181 58 188 389 285 337 248 326 375 598 310
20 Prevotella 38 70 54 53 14 10 65 16 46 0 18 27 16 38 54 37 27 44 18 194 41 0
21 Eubacterium spp 6912 7169 11156 3498 1934 2555 2326 2260 4009 4875 1724 94 220 2721 4129 3670 1866 1385 4541 4060 9049 8102
22 Bacteroides fragilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
23 Staphylococcus 120 295 208 452 154 147 400 274 199 95 102 161 47 162 251 231 339 230 260 189 150 82
24 Bifidobacterium 5067 5006 4509 2207 995 1324 1450 1178 2040 1509 437 206 515 2329 2811 2026 2380 1263 1785 2743 4045 1809
25 Helicobacter pylori 14 47 32 41 1 5 75 17 17 17 11 12 15 17 34 27 26 33 7 44 75 40
26 Clostridium perfringens 12 20 14 19 5 5 66 30 37 89 17 9 35 20 242 78 184 32 11 94 17 15
27 Enterococcus 290 351 343 591 221 313 655 558 324 282 209 235 92 197 319 448 534 367 640 299 655 329
28 Eubacterium 59 10 11 13 0 0 9 10 14 0 0 0 5 5 9 11 12 10 5 3 15 0
29 Propionibacterium spp 4480 4945 3658 2413 828 769 1901 1386 1290 724 1070 312 913 1933 2956 1539 3412 1012 2312 3003 4753 1190
30 Streptococcus mutans 229 180 224 411 75 172 357 305 412 249 390 128 57 99 182 291 291 328 160 4374 410 247
31 Herpes 59 23 27 76 0 0 18 0 15 0 3 0 0 0 0 6 0 8 0 0 122 133
32 Nocardia asteroides 274 963 622 689 376 160 583 521 465 0 0 212 105 258 426 1184 1705 683 0 746 892 203
33 Цитомегаловирус 166 20 10 13 0 15 31 17 15 17 7 5 7 6 13 8 106 6 40 40 15 16
34 Микр грибы 384 190 133 171 25 13 40 149 571 171 43 104 85 68 72 607 494 329 76 98 44 97
35 Ruminicoccus 640 1609 659 1548 1177 1427 542 1315 668 2176 1065 595 319 495 439 1227 439 874 1573 884 1408 248
36 Butyrivibrio/Cl. fimetarum 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 2 0 0 2 19
37 Actinomyces viscosus 1190 814 775 687 355 495 1174 391 735 366 320 216 278 368 745 904 583 737 596 542 1272 779

Данные в размерности [клеток/мл х105]
 
По выработанному ранее статистическому критерию [12], отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой. В таблице 1 и 1а такие случаи выделены серым оттенком. Превышение нормы более чем вдвое – темным серым, уменьшение более чем наполовину – светлым серым. В этом случае таблица приобретает полосатый вид, в котором полосы потемнее отмечают регулярный избыточный рост бактерий в организме, а светло-серые – дефицит.
Как видно из экспериментальных данных изменения носят как общий, так и индивидуальный характер (табл. 1 и 1а). Наблюдается избыточный рост ряда микроорганизмов из состава нормальной микробиоты хозяина, что по определению является инфекцией. Эти случаи темное серое выделение в табл.1 и 1а.   Общим признаком этой части пациентов является более чем двукратное превышение концентраций маркеров, клостридий группы Clostridium ramosum, Eubacterium lentum (Eggertella lenta), видов Pseudomonas,  Moraxella, Helicobacter pylori и актинобактерий Streptomyces, Nocardia. Наибольший прирост численности бактерий приходится на C. Ramosum, Eubacterium lentum, Helicobacter pylori и актинобактерий Streptomyces, Nocardia. К частным признакам относится прирост численности основной группы эубактерий (Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum), Fusobacterium/Haemophylus, клостридий группы С. Perfringens, дрожжей Candida  а также стафилококков и  оральных стрептококков который наблюдается не у всех пациентов. Частично участвуют в инфекционном процессе пептострептококки, анаэробные стрептококки Streptococcus mutans, Propionibacterium jensenii, виды Achromobacter. Грамотрицательные микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae (E. Coli, Proteus, Klebsiella и другие – у них общие маркеры в ранге семейства) – обнаружены в избыточном росте только у четырех пациентов. Другие грамотрицательные бактерии, такие как представители родов  Stenotrophomonas, Acinetobacter, Neisseria, Bacteroides, Burkholderia, Francisella не превышали уровня клинической значимости или предела детектирования. У 19 больных наблюдался общий избыточный рост микробиоты по оценке микроэкологического статуса, а у остальных (N=22) снижалась по сравнению с нормой из-за дефицита лактобацилл,  бифидобактерий, эубактерий пропионобактерий. Случаи снижения концентраций микроорганизмов ниже двукратного уровня выделены в табл. 1 и 1а светлым серым оттенком.
Таким образом, изменения в микроэкологическом статусе пациентов, кандидатов на пересадку печени (в основном вследствие цирроза), проявляются в увеличении численности одной группы бактерий – инфекция, воспаление – и снижение численности другой.
Подробные количественные данные, получаемые методом масс-спектрометрии микробных маркеров, позволяют выявить микробные доминанты потенциальных агентов инфекции. Они служат объективной основой для тактики дальнейшего ведения больного с целью выбора средств ее подавления. Действительно, как видно на примере анализов одного и того же больного до и после лечения, это удается осуществить. В качестве примера можно привести   коррекцию дисбактериоза у одного из больных (рис. 1).

Рис. 1. Дисбактериоз и его коррекция. Применены жидкие концентраты бифидо- и лактобактерий. После лечения микроэкологический статус в основном нормализовался, за исключением того, что лактобацилы не достигли нормы, а численность эубактерий перешла в избыток.
До лечения у больного обнаружен избыток C. ramosum, стрептококков, нокардий и Actinomyces viscosus при существенном недостатке основных микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника – лактобацилл, бифидобактерий, эубактерий и пропионобактерий. После лечения микроэкологический статус в основном нормализовался, за исключением того, что лактобацилы не достигли нормы, а численность эубактерий перешла в избыток. При восстановлении нарушенного  микроэкологического статуса оказалось полезным применение имуномодуляторов (гепон, имуномакс), висмутовых препаратов типа де-нола а также метронидазола, который, как оказалось, кроме подавления внедренных в слизистую оболочку бактероидов стимулирует рост всех микроорганизмов нормальной микробиоты кишечника.
В пробах обследованных пациентов отсутствуют бактероиды, немногочисленны и другие привычные для диагностической практики анаэробы – пептострептококки. Однако выявлены редко культивируемые кишечные анаэробы – виды Eubacterium, Propionibacterium, клостридии группы C. ramosum, а также многочисленные аэробы во главе с оральными стрептококками. Что касается  C.  perfringens, то даже при малых абсолютных концентрациях этот микроб нельзя недооценивать в патологическом плане: он образует как минимум 12 идентифицированных токсинов и энтеротоксин. Мишени для основных токсинов – биологические мембраны в различных тканях. Поражения обуславливают ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление и нарушение клеточной проницаемости с последующим отеком и автолизом тканей, характерными для газовой гангрены.
Клинический случай: Больная А., 57 лет.
Д-з: Цирроз печени вирусной этиологии (HCV+HBV), Child-Pugh А. Портальная гипертензия. Гепатоспленомегалия.
Первичный анализ микроэкологического статуса в апреле 2007г показал дефицит основных компонент нормальной микробиоты: эубактерий (Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum), бифидобактерий и пропионобактерий    при избыточном росте (инфекции)     актинобактерии родов Rhodococcus, Streptomyces, Nocardia, а также Pseudomonas aeruginosa, Moraxella/Acinetobacter, Helicobacter pylori,  Fusobacterium, Eubacterium lentum,  стафилококков, руминококков и дрожжей кандида (табл. 2). Повторное обследование в августе того же года обнаружило увеличение общего дефицита колонизации на 30% при росте численности стрептококков, бацилл,  Clostridium perfringens  и C. propionicum. В то же время уменьшилась численность части условно-патогенной микрофлоры: анаэробных пептострептококков, моракселл, стафилококков, фузобактерий, хеликобактера. После трансплантации произошло резкое снижение численности нормальной микробиоты, вчетверо против нормы,  до  уровня колонизации кишечника, наблюдаемой при синдроме раздраженной кишки [7].  При этом осталась выше нормы количество нокардий, выросла численность группы Moraxella/Acinetobacter и появились бактерии семейства Enterobacteriaceae (E. сoli, Proteus, Klebsiella и другие) общей численностью на уровне 106 клеток/мл.
Таблица 2
Коррекция микроэкологического статуса пациента под контролем масс-спектрометрии микробных маркеров в процессе цикла первичный анализ – коррекция перед операцией трансплантации печени — контроль после операции – восстановление нарушенной микробиоты.

На диаграмме рядом с таблицей наглядно видно снижение численности основных групп микроорганизмов кишечника – лактобацилл, бифидобактерий, клостридий, эубактерий, пропионобактерий и других, а также возвращение к нормальному уровню в процессе реабилитации. В таблице желтым цветом выделены показатели численности микроорганизмов, более чем вдвое превышающие норму (инфекция), а бирюзовым – вдвое ниже нормы – дефицит.
 
Коррекция дисбактериоза
Для коррекции дисбиоза выглядит перспективным применение жидких пробиотиков типа нормофлоринов  или биовестинов. В них на два порядка больше живых бактерий (N=1010), кроме того, жидкая культуральная среда содержит естественный пул ростовых факторов микроорганизмов в качестве пребиотика. Конечно, и этого мало, чтобы восполнить недостаток или подрастить дефицитные лактобациллы или бифидобактерии – дело не в этом. Поскольку в кишечнике их примерно 1012 , то добавка пробиотика не восполняет дефицита по количеству клеток, но на самом деле клинический эффект достигается. Можно предположить, что живые культуры бифидо- и лактобактерий вместе с частью культуральной среды содержат биокаталитические вещества, стимулирующие восстановление не только этих, но и других микробов – то есть восстановление кишечного гомеостаза.

Нормализующее действие на нарушенную микробиоту кишечника оказывает синтетический тетрадекапептид гепон. В отличие от большинства известных иммуномодуляторов гепон обладает противовоспалительными свойствами, противовирусной активностью, способностью к активации местного иммунитета, повышению устойчивости слизистой оболочки к инфекциям. Уровень колонизации микроорганизмами тощей кишки возрастает до пяти  раз в сравнении с исходным уровнем, что актуально для больных СРК, у которых дефицит микробиоты может быть семикратным по сумме микроорганизмов. Базовые кишечные микроорганизмы — эубактерии,  бифидобактерии и клостридии достигают или превышают уровень нормы. Лактобациллы остаются ниже нормы, хотя их численность увеличивается на порядок по сравнению с первоначальной. По многим микробам — кокки, актиномицеты, энтеробактерии, грибы обнаруживается восстановление нормы или избыточный рост более чем на порядок.

Препарат висмута ДеНол, как оказалось, обладает воспроизводимым эффектом оптимизации  общего уровня колонизации тощей кишки и концентрации отдельных микроорганизмов.  То есть нивелирование дисбактериоза в сторону нормы: уменьшение концентрации микробов, проявляющих избыточный рост, и увеличение численности дефицитных микробов. Так реагируют на ДеНол основные обитатели кишечника – бифидобактерии, эубактерии (E. moniliforme, E.nodatum, E.sabureum и пр.) а также пропионовые бактерии. К сожалению, исходный нормальный уровень лактобацилл в большинстве случаев понижается под действием препарата.

Обсуждение

Всего найдено 43 таксона микроорганизмов, маркеры которых имеют клинические значимое (более чем в два раза) превышение нормы (она приведена в первом столбце табл. 1 и 1а слева), то есть могут быть участниками инфекционного процесса. Потенциальная инфекция носит полимикробный характер. У разных пациентов одновременно клинически значимыми могут быть до  24 таксонов микроорганизмов из числа контролируемых. Их Ведущими микроорганизмами в количественном отношении являются анаэробы.  Это клостридии Clostridium ramosum и C. perfringens, эубактерии Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum, E. lentum и руминококки. уровень до 109 клеток/мл. Все они составляют нормальную (индигенную) микробиоту организма человека. Им сопутствует группа кокковых бактерий: стафилококки, стрептококки, энтерококки, которые обычно выявляют при классическом бактериологическом исследовании. Их уровень 107 – 108 клеток/мл. Выше нормы концентрация микроскопических грибов кандида, актинобактерий Streptomyces, Nocardia, Rhodococcus и других, численность которых так же 107 – 108 клеток/мл. Минорную группу по численности (но не по значимости) составляют грамотрицательные микроорганизмы: Moraxella, Pseudomonas aeruginosa, Fusobacterium (альтернативно – Haemophylus), Alcaligenes и Helicobacter pylori. Микробный эквивалент концентрации их маркеров в крови имеет порядок 106 клеток/мл. На самом деле это не означает, что микробы сами присутствуют в крови. Но их маркеры попадают в кровь из зоны локализации инфекции – кишечник, перитонеальная зона, респираторные органы и т.п., где их концентрация может быть выше на порядок и более.

Из экспериментальных данных следует, что измерение микробных маркеров в крови  выявляет новую группу микроорганизмов из числа трудно культивируемых, и поэтому, мало известных в клинической практике. Эти участники инфекционного процесса — клостридии, эубактерии, лактобациллы, хеликобактеры, стрептомицеты, родококки — обладают высокой патогенетической активностью. Она известна из специфически связанных с этими организмами нозологий, каждая из которых воспринимается сама по себе как серьезное заболевание, трудно поддающееся лечению. Клостридии групп перфрингенс и рамозум (группа RIC – ramosum, inocuum, clostridioforme) – это гангрена, эубактерии – септический артрит, H. pylory – язвенная болезнь желудка, языка и атеросклероз; стрептомицеты и другие актинобактерии — туберкулез, нокардиозы и актиномикозы.

По нашим данным в 14 случаях из 41 в крови обнаруживается высокая концентрация маркеров эубактерий. Eubacterium – родственные клостридиям микроорганизмы, являющиеся одними из основных обитателей кишечника. Условные патогены с развитой системой видов и штаммов с универсальными свойствами. В том числе для них характерно индуцирование продукции провоспалительных цитокинов и TNF-alfa, а также противовоспалительного цитокина IL-10 (как ЛПС или клеточные токсины Грам+ патогенов). Это обуславливает их участие в патологиях тяжелых заболеваний, таких как, средиземноморская семейная лихорадка, эндокардит, врожденный порок сердца, кожные и кишечные патологии, связанные со сложным изменением концентрации их видов в биотопах.  Eubacterium lentum известен как микроорганизм, ассоциированный с ректальным раком и продуцирующий хориогонадотропин-подобный имунореактивный материал [11]. Известен также как агент септического артрита и синуситов.

  1. pylory– микроорганизм, хорошо известный участием в микробной этиологии язвенной болезни, в последнее время обнаруживается и в других органах – полости рта, печени, прямой кишке, атеросклеротических бляшках. На этом фоне обнаружение H. pylori в других отделах пищеварительного тракта в норме и патологии не выглядит странным. Патогенность H. pylory известна: проникая через слизь, бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам, проникают в железы слизистой оболочки. ЛПС микроорганизмов способствует миграции нейтрофилов и развитию острого воспаления. Под действием бактериальной уреазы мочевина превращается в аммиак, повреждающий слизистую оболочку.

Родококки – факультативные внутриклеточные бактерии, способные персистировать и вегетировать в макрофагах и других клетках высших организмов, вызывая в конечном счете их разрушение. Результирующее действие родококков вызывает поражение тканей аналогичное микобактериям туберкулеза [14]. Они вырабатывают   ферменты, гидролизующие липиды (например – холестеролоксидазу) которые токсичны для организма человека и животных. Биопсия тканей, пораженных родококками, выявляет многочисленные полиморфоядерные лейкоциты, вспученные клетки и каверны с внутриклеточными бактериями. Большинство штаммов родококков чувствительны к гликопептидным антибиотикам, включая ванкомицин и тейкопланин, и к рифампину. Макролиды, такие как эритромицин и кларитромицин также ингибируют рост многих штаммов. Родококки устойчивы к бета-лактамным (за исключением карбапенемов, особенно имипенема) антибиотикам, хотя это свойство не связано с продукцией бета-лактамазы. У людей, имеющих контакт с домашними животными, нередко причиной пневмонии и распада легкого является Rodococcus equi. Поскольку это внутриклеточный патоген, антибиотик должен проникать внутрь клеток. В таких случаях длительно применяют комбинацию эритромицина (или других новых макролидов) с рифампицином

На наш взгляд, приведенные данные подтверждают существующее суждение о патогенетическом участии в инфекционном процессе микроорганизмов кишечника [4, 13], заполняя тем самым пробелы в представлении о том, какие именно таксоны микроорганизмов в нем участвуют, в каком количественном выражении и как часто. Авторы надеются также, что  эта информации послужит поводом для расширения понятия эндотоксикоз [3, 5] при инфекции в области хирургического вмешательства путем включения в  число продуцентов токсинов грамположительных бактерий – основных обитателей кишечника: эубактерий, лактобацилл, клостридий, пропионобактерий и актинобактерий в первую очередь. Популяции этих бактерии, как и все прочие микроорганизмы, при избыточном росте (инфекции) с наибольшей вероятностью вырабатывают токсигенные штаммы и провоспалительные факторы. Известно, что анаэробы являются основными обитателями организма человека. Их участие в раневой инфекции и сепсисе не вызывает сомнений, а доля участия приближается, по данным многочисленных работ, к их доле в его микроэкологическом статусе [13]. Принципы эмпирической АБТ также подтверждают участие анаэробов и актинобактерий, поскольку эффективным лечение становится тогда, когда в препараты выбора включен амоксиклав (действующий на клостридии и эубактерии) с метронидазолом, а также амикацин, к которому чувствительны практически все актинобактерии [15].

Литература 

  1. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином. Вестник РАМН. -1999. T.16, -№7, с. 25-31
  2. Белобородова Н.В., Хабиб О.Н. Антибактериальная терапия инфекционного эндокардита. Анналы хирургии. – 1999. Т. 6. – С. 67-77.
  3. Брискин Б. С.. Еще раз к вопросу о сепсисе.Инфекции в хирургии, Т. 2. № 4 с 33-36
  4. Гельфанд Б. Р., Руднов В. А., Проценко Д. Н., Гельфанд Е. Б., Звягин А. А., Ярошецкий А. И., Романовский Ю. Я.  Сепсис: определение, диагностическая концепция, патогенез и интенсивная терапия. Инфекции в хирургии, Т. 2, № 2 с.2-16
  5. Ерюхин И.А., Шашков Б.В. Эндотоксикоз в хирургической клинике, С.-Пб, изд. Логос, 1995, 304с.
  6. Осипов Г.А. Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах.  Вестник РАМН. -1996, Т.13,-№2,- С.52-59
  7. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В., Ручкина И.Н., Курчавов В.А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л.Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально-биохимическим и хромато-масс-спектрометрическим методами. Эксп. Клин. Гастроэнтерология. 2003. Т. 4, С. 59-67
  8. Хабиб  О.Н., Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Детектирование молекулярных маркеров бактерий в ткани клапанов сердца в норме и при патологии с применением метода газовой хроматографии и масс-спектрометрии.  Журн. Микроб. Эпидем. Иммун., 2004,  № 3: 62-68
  9. Хабиб О.Н., Белобородова Н.В.. Роль анаэробов в этиопатогенезе инфекционного эндокардита. Инфекционные болезни, 2004; 2: 74-81
  10. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Издание в 3-х томах, Т1. -М., Грант, 1998
  11. Acevedo H. F., Slifkin M., Pouchet-Melvin G. R., Campbell-Acevedo E.A.. Choriogonadotropin-Like Antigen in an Anaerobic Bacterium, Eubacterium lentum, Isolated from a Rectal Tumor. Infection and Immunity, June 1979, Vol. 24, No.3 p. 920-924.
  12. Beloborodova N.V., Osipov G.A.  Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship. Microb. Ecol.Heal.Dis., SCUP. — 2000.- Vol. 12. – P. 12-21.
  13. BowlerG., Duerden B. I., Armstrong  D. G., Wound Microbiology and Associated Approaches to Wound Management. Clinical Microbiology Reviews Apr. 2001, p. 244–269 Vol. 14, No. 2
  14. Linder R.Rhodococcus equi and Arcanobacterium haemolyticum: Two “Coryneform” Bacteria Increasingly Recognized as Agents of Human Infection. Emerging Infectious Diseases Vol. 3, No. 2, April–June 1997
  15. McNeil M.M., Brown J.M., Jarvis W.R., Ajello L. Comparison of species distribution and antimicrobial susceptibility of aerobic actinomycetes from clinical specimens. Rev Infect Dis. 1990 Sep-Oct;12(5):778-83

Авторы
Андрейцева Ольга Ивановна
Киселев Владимир Валерьевич, 117570 Красного Маяка ул., д. 13А., к. 1, кВ. 49.
8-9096756513 (для переписки)
Осипов Георгий Андреевич, 109202 3-я Карачаровская ул., д 4 кор 2 кв 1
8-903-558-31-26 (для переписки)
Федосова Наталья Федоровна
Лядов Константин Викторович

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *