ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА, АКТИВНОГО В БИОТРАНСФОРМАЦИИ МИНЕРАЛОВ ЖЕЛЕЗА В КАОЛИНЕ

  • Главная
  • Статьи

Скачать оригинал 
 

Е. С. Турова, Г. А. Осипов

Институт микробиологии РАН, Москва
Поступила в редакцию 10.11.95 г., МИКРОБИОЛОГИЯ. 1996, том 65. № 5. с. 8-689

 

Для экспрессного определения структуры активного в трансформации минералов железа в каолине микробного сообщества применен метод хромато-масс-спектрометрии. На основании перечня членов сообщества, выявленных с применением традиционных физиолого-биохимических методов, сформирован банк данных состава липидных компонентов клеток микроорганизмов сообщества. Исходя из состава жирных кислот, оксикислот и альдегидов суммарной биомассы сообщества, определенных ГХ-МС, перечень членов сообщества уточнен и определено их количество. В основу расчета положен принцип соответствия химического маркера и профиля. Составлена и оптимизирована система уравнений баланса, в которых концентрация каждого анализируемого вещества биомассы приравнена сумме вкладов членов сообщества, имеющих данное вещество в составе клетки. Разработанный алгоритм расчета позволит в дальнейшем проводить экспрессное определение структуры подобных сообществ по данным жирно-кислотного состава биомассы без выделения чистых культур.

Процесс биотрансформации минералов железа в каолине практически не изучен. Но известно, что в таких природных процессах, как образование нежелательно высоких концентраций растворимого железа в грунтовых водах, глееобразование, намагничивание (magnetization) водных осадков, ведущая роль принадлежит микробному восстановлению Fe(III) до Fe(II) [1]. Показана роль различных групп микроорганизмов в растворении, восстановлении Fe(lft) и образовании железоорганических комплексов [2]. Это бактерии — представители родов Bacillus, Enterobacter, Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Proteus, Clostridium, Corynebacterium, Vibrio, Paracoccus, Bacteroides, Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Achromobacter, Staphylococcus, Spirillum и микроскопические грибы — представители родов Actinomucor, Alternaria и Fusarium. Изолированы штаммы, способные к диссимиляторному восстановлению железа: факультативно-анаэробный организм Shewanella putrefaciens [3J и строгий анаэроб Geo- bacter metallireducens, штамм GS-15 [4]. Хотя показано, что при росте на аморфном гидроксиде железа в лабораторных условиях Sh. putrefaciens и G. metallireducens могут образовывать магнетит (Fe3O4) [5], нет данных о том, что они активно вовлечены в этот процесс в природе.
Круг работ, посвященных изучению структуры железовосстанавливающих сообществ, ограничен. Колеман с соавт. [6], анализируя методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ-МС) липидные биомаркеры микробного сообщества морских осадков, показали, что современное образование конкреций сидерита (FeCO3) в этих осадках является результатом активности сульфатвосстанавливающих бактерий.
Наличие специфических веществ (маркеров) в клеточных компонентах и микробных метаболитах микроорганизмов открывает возможность для направленного поиска и идентификации микроорганизмов в сообществах с использованием высокочувствительных методов — масс-фрагментографии или газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Известно, что при изменении состава среды, условий культивирования и возраста культур определенным образом меняются и жирно-кислотные профили микроорганизмов. Тем не менее показано, что, если питательная среда и условия роста стандартизованы, жирно-кислотные профили для индивидуальных штаммов воспроизводимы и могут быть использованы для хемотаксономических целей [7]. Существует практика описания структуры сообществ микроорганизмов с использованием жирно-кислотного профиля [8, 9].
Осипов с соавт. [10] для экспресс-анализа состава накопительной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий из заводняемого нефтяного пласта Талинского нефтяного месторождения впервые применили расчетный метод, позволивший определить состав микроорганизмов не только качественно, но и количественно. Результаты расчета подтверждены с помощью традиционных микробиологических методов.
В результате предварительных исследований нами было получено сообщество микроорганизмов, активное в биотрансформации минералов железа в глинах, использующихся в качестве керамического сырья [11]. Валовое содержание железа в каолинах составляет 0.6-0.8%. При этом часть железа находится в кристаллической решетке алюмосиликатов и оказывает малое влияние на цветность и белизну фарфоровых изделий. Ощутимо снижает их качество то железо, которое входит в состав оксидов — гетита a-FeOOH и гематита a-Fe2O3. В результате развития сообщества происходит трансформация трудноудалимых примесей каолинов — гетита и гематита в соединения, подвергающиеся магнитной сепарации.
Целью настоящей работы является анализ структуры указанного микробного сообщества исходя из данных жирно-кислотного состава суммарной биомассы, получаемого с помощью ГХ-МС.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследуемое сообщество микроорганизмов поддерживается пересевом на стерильную суспензию каолина Просяновского месторождения с добавлением питательной среды. Эксперимент проводили следующим образом: к водной суспензии каолина (Т: Ж = 3 : 1) добавляли 20 об. % среды следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 — 0.2, MgSO4 ■ 7Н2О — 0.2, КН2РО4 — 1, глюкоза — 5. Затем вносили инокулят (10 об. %). Инкубацию проводили при 30°С. При этом происходило расслоение суспензии на осадок и верхний слой — жидкую фазу. Для изучения структуры сообщества отбирали пробу осадка после двухнедельной инкубации. В качестве контроля использовали исходную водную суспензию каолина.
Состав сред и методы учета микроорганизмов. Для выявления отдельных физиологических групп микроорганизмов сообщество анализировали путем посева на жидкие и плотные питательные среды методом предельных разведений. Численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов определяли посевом на разведенный (1 : 10) МПБ, анаэробных бродильных микроорганизмов — в столбик среды Виноградского [12], сульфатвосстанавливающих бактерий — на среду Постгейта [13] с лактатом натрия (4 г/л), железовосстанавливающих микроорганизмов — на среду Лавли с аморфным гидроксидом железа [14].
Аналитические методы. Формиат, ацетат, пропионат и бутират определяли газохроматографически, лактат — с помощью лактатдегидрогеназы, глюкозу — с помощью глюкозооксидазы и феррицианида калия [15], сероводород — методом Трюпера с диметил-п-фенилендиамином [16], содержание растворенного в жидкости железа — на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin-Elmer 3100.
Аппаратура. Исследования жирно-кислотного состава проводили на хромато-масс-спектрометре НР-5985В фирмы “Hewlett-Packard” (США). Масс-спектрометр квадрупольный с диапазоном масс 2-1000 аем имеет разрешающую способность 0.5 аем во всем рабочем диапазоне. Ионизация электронами 70 эВ. Чувствительность прибора составляет 1 нг по метилстеарату в режиме непрерывного сканирования и 10 пкг в режиме селективных ионов. Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленного кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0.2 мм. Неподвижная фаза Ultra-1 “Hewlett-Packard” с толщиной слоя 0.32 мкм. Хроматографирование проводили в режиме программирования температуры от 50 до 320°С со скоростью 5 град/мин. Температура инжектора и интерфейса 250°С.
Экстракцию липидов из пробы каолина осуществляли по методу Фолча смесью хлороформ-метанол-вода [17]. К навеске осадка (3 г) приливали 5 мл смеси и выдерживали 1.5 ч при комнатной температуре, дважды инициируя экстракцию на вибраторе “Vortex”. После экстракции смесь центрифугировали при 3000 об/мин. Супернатант отделяли, добавляли воду до получения бифазной системы. Нижнюю, хлороформную фазу, содержащую сумму липидов каолину, отделяли микропипеткой и высушивали.
Извлечение фракции жирных кислот проводили путем кислого метанолиза в 4.5N НС1 в сухом метаноле в течение 1.5 ч при температуре 70°С. После проведения реакции образовавшиеся метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном, экстракт высушивали и обрабатывали в 20 мкл №0-6ис-(триетилсилил)трифторацетамида для получения летучих производных оксикислот. 4 мкл реакционной смеси вводили в инжектор хроматографа для анализа. Анализ проводили в две стадии: в режиме непрерывного полного сканирования веществ пробы, элюируемых хроматографом, и в режиме селективных ионов (масс-фрагментографии). Вторая стадия потребовалась для измерения концентрации минорных компонентов жирно-кислотного состава биомассы и проводилась по специально составленной программе, позволяющей в нужное время записывать концентрацию специфических ионов маркерных веществ микроорганизмов и обходить интенсивные хроматографические пики ведущих микроорганизмов сообщества и неспецифического биологического фона.
Расчет состава микробного сообщества проводили с помощью электронных таблиц “EXCEL”.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ сообщества с применением микробиологических методов. Данные количественного учета микроорганизмов и анализ продуктов метаболизма позволяют оценить развитие отдельных физиологических групп микроорганизмов в суспензии каолина при добавлении посевного материала и питательной среды. В эксперименте на 14-е сут культивирования глюкоза в среде была практически исчерпана, появились продукты метаболизма — летучие жирные кислоты (бутират — 0.2 г/л, ацетат — 0.12 г/л, пропионат — 0.03 г/л, лактат — 0.02 г/л и формиат — 0.01 г/л) (рис. 1), сероводород (6.9 мг/л) и растворимое железо (0.5 мг/л). По данным количественного учета численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов составила 10б кл/г, анаэробных бродильных бактерий — 105 кл/г, сульфатвосстанав ливающих бактерий — 105 кл/г, железовосстанавливающих бактерий — 102 кл/г (рис. 2).
Летучие жирные кислоты, г/л Глюкоза, г/л

Рис. 1. Изменения химического состава суспензии каолина. I — глюкоза, 2 — бутират, 3 — ацетат, 4 — лактат, 5 — формиат, 6 — пропионат.

Рис. 2. Динамика численности микроорганизмов. Бактерии: 1 — железовосстанавливающие, 2 — суль- фатвосстанавливающие, 3 — бродильные, 4 — аэробные гетеротрофные.
Анализ жирно-кислотного состава суммарной биомассы сообщества. В результате ГХ-МС анализа в метанолизате липидной фракции суммарной биомассы сообщества определено 54 вещества из класса жирных кислот, оксикислот и альдегидов (табл. 1). В таблице приведены их относительные концентрации в мол. %, а также те таксоны микроорганизмов, у которых эти вещества встречаются в составе липидов клетки. Данные приведены за вычетом содержания жирных кислот в исходном каолине. В данном случае их суммарное содержание на превышает 10% от суммы жирных кислот в опыте. Проба исходного каолина содержала 103 кл/г аэробных гетеротрофных бактерий, 102 кл/г бродильных микроорганизмов и единицы кл/г сульфатвосстанавливающих бактерий, что на два-три порядка меньше количества, вносимого с посевным материалом (рис. 2).
Некоторые специфические вещества (маркеры) охватывают крупные группы микроорганизмов. Например, метилотрофные бактерии определяются по 7,8-гексадеценовой (16 : ld7) кислоте. Микроскопические грибы определяются в целом по линолевой кислоте (октадекадиеновой, 18:2). Ряд бактерий можно определить до рода: Desulfovibrio (по изогептадеценовой кислоте, 117 : 1), Desulfobacter (по 10-метилгексадекановой кислоте, 10Ме16 : 0), Bacteroides (по 3-оксиизотетрадекановой, hi 14) и т.д. В этом случае для характеристики сообщества используются данные типового вида. Отдельные роды, например Pseudomonas или Bacillus, гетерогенны по химическому составу, что позволяет выделять членов рода в сообществе по видовым маркерам. Так, по наличию 2-оксилауриновой кислоты (2h12 : 0) можно определить содержание микроорганизмов Pseudomonas putida, по антеизотридекановой кислоте (а 13 : 0) — Bacillus cereus, а по нормальной тридекановой кислоте (13 : 0) — В. subtilis.
Некоторые вещества, указанные в табл. 1, характерны для всех или большинства микроорганизмов. Это пальмитиновая, стеариновая, миристиновая, олеиновая, лауриновая кислоты и некоторые другие вещества. Они неспецифичны и используются для проверочных расчетов при подведении материального баланса веществ и для выявления неучтенных в банке данных организмов.
По полученным нами данным количественного учета микроорганизмов можно предположить наличие в сообществе аэробных и факультативно-анаэробных гетеротрофных бактерий — представителей Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, а также анаэробных бактерий — представителей рода Clostridium, сульфатвосстанавливающих и железовосстанавливающих бактерий.
Таблица 1. Жирно-кислотный состав суммарной биомассы сообщества

Краткое обозначениеСодержание, мол. %Характерный микроорганизм
С12:02.85Большинство микроорганизмов
iC130.06Bacillus subtilis
а130.24Bacillus cereus
13 :00.56Bacteroides, Bacillus, Nocardia
I140.10Actinomyces, Bacillus, Bacteroides, Legionella, Kurthia
14 : 1D91.27Sphaerotilus, Clostridium
14:010.18Большинство микроорганизмов
il5: 10.08Desulfovibrio, Flavohacterium
il50.45Многие микроорганизмы
al50.56Многие микроорганизмы
15 : 10.99Nitrobacter, Deinocossus, Micrococcus
15 :05.45Большинство микроорганизмов, минорный компонент
16 1D70.37Methanogens, Deinococcus, Desulfotomaculum acetoxidans, Desulfobacterium
16 1D99.42Большинство микроорганизмов
16: lD110.37Bdellovibrio, Vibrio, Fusobacterium, Bacteroides amylophilus
i16:00.26Actinomyces, Nocardiopsis. Bacteroides, Micromonospora, Brevibacterium, Cellulomo- nas, Corynebacterium, Curtobacterium, Oerskovia,
16:027.24Большинство микроорганизмов
il7: 10.83Desulfovihrio, Flavohacterium
17: 10.41Candida albicans, Nocardiopsis, Clostridium, Methanogens
il7 :00.46Butyrivibrio, Bacillus, Prevotella, Propionibacterium и другие
al7 :00.77Corynebacterium, Bacteroides, Nocardiopsis, Actinomyces, Nocardia, Micromonospora
17 eye0.22Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Desulfohacter, Desulfobacterium
17 :02.04Большинство микроорганизмов, минорный компонент
18:22.79Грибы, дрожжи, простейшие
18 : 1D915.25Все организмы
18 : 1D113.91Nitrobacter, Bdellovibrio, Penicillum, Ruminohacter amylophilus, Succinivibrio, Campylobacter, Fusobacterium, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, сульфатвосстанавливаю- щие бактерии
18:00.76Все организмы
19 eye0.04Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Brucella, Campylobacter
19:00.88Nitrobacter, Burkholderia cepacia, Bacillus, Serratia
20:01.22Actinomyces
24:01.49Francisella, Mycobacterium
119QJOBacillus subtilis, Bacteroides hypermegas
al 90.30Staphylococcus
10Mel60.10Desulfohacter
10Mel80.05Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium, актиномицеты

ОКСикислоты

hl00.01Pseudomonas. Thiohacillus, Leptothrix
h120.01Pseudomonas, Neisseria gonorrhoeae, Beggiatoa, Vibrio
hil30.01Stenotrophomonas maltophilia
h130.01Escherichia coli, Bacteroides hypermegas, Selenomonas
h140.03Enterobacteriaceae, Fusobacterium, Haemophilus, Wolinella, Vibrio, Campylobacter
hal50.01Bacteroides ruminicola

 Таблица 1. Окончание

Краткое обозначениеСодержание, мол. %Характерный микроорганизм
hi150.01Flavobacterium, Capnocytophaga, Bacteroides melaninogenicus
hi60.07Erwinia, Brucella, Burkholderia cepacia, Ps. pseudomallei. Bacteroides, Wolinella, Cy- tophaga, Flexibacter, Methanogens, Campylobacter, Fusobacterium, Bordetella
hi 170.02Bacteroides, Flavobacterium. Cytophaga, Flexibacter
hal70.02Bacteroides riminicola
hl70.01Bacteroides riminicola, B. thetaiotaomicron
10h180.06Clostridium
2h120.02Pseudomonas putida
2hil50.02Flavobacterium, Flexibacter
Альдегиды
14a0.68Butyrivibrio, Spirochaeta, Bifidobacterium
il5a0.05Butyrivibrio, Lactobacillus, Propionibacterium
16a2.55Clostridium, Lachnospira, Butyrivibrio, Lactobacillus
18; la0.32Lachnospira, Butyrivibrio, Bifidobacterium, Selenomonas, Clostridium butyricum
18a4.06Clostridium

Примечание. Вещества обозначены по общепринятой системе. Например, в символе 3hi 17 : 0 содержатся сведения о том, что это оксикислота (h-гидрокси) с ) 7 атомами углерода (гептадекановая), насыщенная (0 после двоеточия) с гидроксилом на третьем атоме углерода от карбоксильного конца молекулы. Значок «а” в конце аббревиатуры означает альдегид. В символе 16 : 1Д11 содержатся сведения о том, что это гексадеценовая кислота, одна двойная связь которой (единица после двоеточия) расположена после 11-го атома углерода (All).
Анализ жирно-кислотного состава суммарной биомассы сообщества заставляет предположить также возможное присутствие нитрифицирующих бактерий, нокардиоформ, метилотрофных бактерий, представителей родов Caulobacter, Deinococcus и Bacteroides.
Составление локального банка данных. Анализ липидных компонентов чистых культур микроорганизмов обнаруживает, что если рассматривать очень широкий круг таксонов, то теряют свою исключительность практически все маркерные вещества, приписываемые одному роду или виду. При ограничении банка данных предполагаемыми членами конкретного микробного сообщества вероятность перекрестных определений значительно снижается. Ранее были сформированы банки данных, включающие перечень микроорганизмов и их химический состав, для сообществ активного и речного илов, метантенка, торфа [18]. На основании перечня членов сообщества, выявленных с применением традиционных физиолого-биохимических методов, нами сформирован банк данных состава липидных компонентов клеток микроорганизмов сообщества каолина. Исходя из состава жирных кислот, оксикислот и альдегидов суммарной биомассы сообщества перечень дополнен микроорганизмами, химические признаки которых присутствуют в составе биомассы каолина (табл. 1). Далее, из этого списка исключены организмы, явно не соответствующие этой экологической нише, например термофилы, галофилы, специфические обитатели организма человека и животных. В результате для дальнейшего анализа принят следующий состав возможных членов сообщества каолина: Pseudomonas putida, Ps. stutzeri, Burkholderia cepacia, Shewanella putrefaciens, B. cereus, B. subtilis, Methylococcus capsulatus, Nocardia, Enterobacter, Arthrobacter globiformis, Caulobacter, Deinococcus, Bacteroides ruminicola, Desulfovibrio, Desulfobacter, Clostridium butyricum, Nitrobacter. При составлении локального банка данных использовали литературные сведения по жирно-кислотным профилям указанных микроорганизмов.
Алгоритм расчета. В общем случае, если присвоить веществам на хроматограмме суммарной биомассы индексы i, а микроорганизмам индексы j, то для т веществ хроматограммы суммарной биомассы сообщества, включающего в качестве членов п родов (видов) микроорганизмов, можно составить систему из т уравнений для п неизвестных:

где Аi— — площадь пика вещества на хроматограмме суммарной биомассы, Xj число клеток микроорганизма в 1 г пробы, Rij — процентное содержание i-того вещества в жирно-кислотном профиле определяемого j-того микроорганизма, q  коэффициент пропорциональности, учитывающий условия анализа и чувствительность прибора: q = = 1/(q1q2S), где q1 = mпробыv/V учитывает долю пробы, попадающей в хроматограф mпробы— масса пробы, V- объем раствора на стадии силилирования пробы, v — объем раствора, введенного в хроматограф); q2 = Qm0/100 выражает массу жирно-кислотной фракции одного микроорганизма (2 — процентное содержание липидных мономеров в клетке, m0 — масса одного микроорганизма); S — коэффициент чувствительности прибора; S = Aстанд//mстанд, где Астанд — площадь пика стандарта (вещества с заранее известной концентрацией), а шстанд ~ количество стандарта при калибровке.
Чтобы использовать коэффициент q в уравнениях системы (1), q принимается равным для всех веществ жирно-кислотной фракции и всех учитываемых микроорганизмов.
Система имеет единственное решение при m = n, если уравнения независимы. В данном случае это означает неразличимость (невозможность раздельного вычисления) двух разных видов микроорганизмов с одинаковым профилем жирных кислот и альдегидов.
Решение системы имеет вид Xj DJ/D, где Dj детерминант частной матрицы коэффициентов для j-того компонента, D  детерминант системы уравнений.
Возможное число уравнений в системе равно числу компонентов жирно-кислотного пула клетки, определяемых методом хромато-масс-спектрометрии. В нашем банке данных их 150. Но у каждого микроорганизма в составе липидов насчитывается всего 10-20 веществ из этого списка. Это означает, что большинство коэффициентов Rij в уравнениях системы равны нулю. Значит система вырожденная, ее можно свести к нескольким подсистемам с меньшим рангом (‘шелом неизвестных). Так как реальное число членов известных сообществ равно 30-40, а число определяемых веществ в биомассе конкретного сообщества 70-80, то мы имеем возможность подобрать такие 30-40 уравнений, чтобы ранг подсистем был минимален. Наконец, надо учесть, что многие вещества микроорганизмов в рамках конкретного сообщества имеют ранг маркеров — представляют только один таксон. Количество таких микроорганизмов определяется по концентрации этого маркера Xj = Aiq/Rjj, тем самым сужая ранг системы в целом. Остальные микроорганизмы можно определить по заранее составленным формулам, полученным в результате решения уравнений с двумя, иногда с тремя неизвестными.
Первым этапом расчета является определение количества микроорганизмов Xj по величинам пиков отдельных жирных кислот и альдегидов.
Вторым этапом является составление баланса для величин пиков веществ хроматограммы: D Ai=∑XiRjiIq
Очевидно, что для веществ, имеющих ранг маркера, DА, = 0. В случае веществ, характерных для большинства или нескольких микроорганизмов, DА, может оказаться отличным от нуля. Вещества с положительным балансом DА, служат для выявления неучтенных в локальном банке данных микроорганизмов. Наличие веществ с отрицательным балансом DА, указывает, что количество каких-либо микроорганизмов было рассчитано ошибочно. Ошибка обусловлена собственно погрешностью подготовки проб и аналитических измерений. Эта ошибка относительно невелика. Она составляет примерно 20%. Более существенная погрешность возникает из-за несоответствия состава жирных кислот микроорганизмов банка данных и изучаемого сообщества. И наконец, она может возникать при определении грамотрицательных организмов по оксикислотам, которые при отмирании клеток не участвуют в процессах катаболизма и их включение в расчет приводит к завышению количества живых клеток.
Отрицательные величины DА, выявлены для следующих жирных кислот: i13:0,i14:0,il5,al5, il6,16:1D7,16:1D9,П7:1,il7,al7,17:0,17: l,3h16.
Третьим этапом является составление и решение системы уравнений для веществ с отрицательным балансом: Aiq=∑kjXjRji,  где kj  поправочный коэффициент, учитывающий ошибку расчета количества микроорганизмов, 0 < kj< 1.
Например, для изотридекановой кислоты (i13 : 0) уравнение выглядит следующим образом: Ai13:0q=4kBcXBc+8.1kBsXBs+0.6kDbXDb, или 750000 = = 3326400kBc+ 5234463kBs+ TL232kDb, где кВс, kBs, kDb — поправочные коэффициенты для расчета количества Bacillus cereus, В. subtilis и Desulfobacter. В результате реализации этого этапа из списка членов сообщества исключены микроорганизмы с kj = 0. Это Sh. putrefaciens, Ps. stutzeri, В. cereus, Methylococcus capsulatus и Enterobacter. Для расчета количества Arthrobacter globiformis, В. subtilis, Deinococcus, Desulfobacter и Desulfovibrio получены поправочные коэффициенты, равные 0.25, 0.14, 0.08, 0.24 и 0.37 соответственно.

Полученные коэффициенты введены в уравнения баланса. После учета вклада всех предполагаемых членов сообщества баланс концентраций дал остаточный профиль невостребованных компонентов химического состава биомассы, который свидетельствует о неучтенных микроорганизмах. По определенной части остатка идентифицирована анаэробная железовосстанавливающая бактерия, выделенная параллельно из данного сообщества путем посева на плотную среду Лавли и обозначенная нами как штамм FeRed. Штамм FeRed выделен из единичной черной колонии, для него определен состав жирных кислот, опознанный в части профиля остатка суммарной биомассы по специфическому компоненту — окситридекановой кислоте (3hl3), а также редко встречающимся у бактерий ненасыщенным кислотам — пентадеценовой (15 : 1) и гептадеценовой (17 : 1). Штамм FeRed добавлен в конечный список микроорганизмов сообщества каолина. Он отличается от известных диссимиляторных желе- зоредукторов Sb. putrefaciens [19] и G. metallireducens [4], у которых состав жирных кислот иной. Другая часть остатка профиля жирных кислот суммарной биомассы каолина, включающая линоленовую кислоту (18 : 3) и пропорциональную ей долю профиля, относится к липидному профилю грибов. Остающийся после его вычитания набор компонентов не содержит признаков конкретных микроорганизмов и может быть определен как неспецифический биологический фон.
Структура микробного сообщества каолина. Таким образом, анализ структуры микробного сообщества каолина, выполненный традиционными физиолого-биохимическими методами и основанный на особенностях липидного состава суммарной биомассы позволил определить родовой, а в некоторых случаях и видовой состав сообщества (табл. 2). Автотрофные бактерии представлены Nitrobacter sp. Посев пробы осадка на селективную среду [20] подтвердил присутствие нитрифицирующих бактерий, осуществляющих II фазу нитрификации. Аэробные и факультативно-анаэробные гетеротрофные бактерии представлены родами Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Nocardia, Caulobacter, Deinococcus и Arthrobacter. Анаэробные микроорганизмы — родами Clostridium, Bacteroides, Desulfovibrio и Desulfobacter. Идентифицированы железовосстанавливающий микроорганизм — штамм FeRed и представитель микроскопических грибов. В дальнейшем будет выясняться роль каждой группы микроорганизмов сообщества в трансформации минералов железа в каолине.
Использованный нами метод определения состава микробных сообществ по данным ГХ-МС анализа жирных кислот суммарной биомассы дал положительные результаты в применении к расшифровке сообщества микроорганизмов каолина и может послужить в дальнейшем для изучения взаимодействий микроорганизмов при биотрансформации минералов.
Авторы выражают глубокую благодарность Г.И. Каравайко за обсуждение результатов исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
  1. Lovley DR.Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction // Rev. 1991. V. 55. P. 259-287.
  2. Myers C.R., Nealson K.H.Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor // 1988. V. 240. P. 1319-1321.Lovley D.R., Phillips E.J.P.. Lonergan D.J. Hydrogen and formate oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese by Alteromonas putrefaciens H Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 700-706.
  3. Lovley D.R., Giovannoni S.J.. White D.C., Champine J.E., Phillips E.J. P., Gorby Y.A.. Goodwin S.Geobacter metallireducens gen. nov. sp. nov., a microorganism capable of coupling the complete oxidation of organic compounds to the reduction of iron and other metals // Microbiol. 1993. V. 159. P. 336-344.
  4. Lovley D.R.Magnetite formation during microbial dissimilatory iron reduction // Iron biominerals / Frankel R.B., Blakemore R.P N.Y.: Plenum Press, 1990. P. 151-166.
  5. Coleman M.L., Hedrick D.B.. Lovley D.R.. White DC., Kenneth Pye.Reduction of Fe(III) in sediments by sul- phate-reducing bacteria// 1993. V. 361. P. 436- 438,
  6. Vainshtein M., Hippe H., Kroppenstedt R.M.Cellular fatty acid composition of Desulfovibrio species and its use in classification of sulfate-reducing bacteria // System. Appl. Microbiol. 1992. V. 15. P. 554—566.
  7. Bobbie R.J., While DC.Characterization of bentic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters // Environ. Microbiol. 1980. V. 39. P. 1212-1222.
  8. Nichols P.D.. Mancuso C.A., White D C.Measurement of methanotroph and methanogen signature phospholipids for use in assessment of biomass and community structure in model system // Geochem. 1987. V. 11. №6. P. 451-462.
  9. Осипов Г.А.. Назина Т.Н., Иванова А.Е.Изучение видового состава микробного сообщества заводняемого нефтяного пласта методом хромато- масс- спектрометрии Ц Микробиология. 1994. Т. 63. Вып. 5. С. 876-882.
  10. Авакян З.А., Платов Ю.Т., Халиуллова Р.А.. Турова Е.С., Каравайко Г.И., Масленникова Т.Н., Во- дяницкий Ю.Н.Способ отбеливания керамических материалов. Заявка № 95116993; 11.10.95.
  11. Кузнецов СИ., Дубинина Г.А.Методы изучения водных микроорганизмов. М.: Наука, 1989. 286 с.
  12. Postgate J.R.Media for sulfur bacteria // Laboratory Practice. 1966. V. 15. № 11. P. 1239-1244.
  13. Lovley D.R.. Phillips E..I P.Organic matter mineralization with reduction of ferric iron in anaerobic sediments H Environ. Microbiol. 1986. V. 51. P. 1212-1222.
  14. Шербухин В.Д.. Миронова Л.И., Кондырева A.B., Грюнер В.С.Определение глюкозы в патоке глю- козооксидазным методом с использованием феррицианида калия Ц Прикл. биохимия и микробиология. 1970. Т. 6. Вып. 4. С. 467^170.
  15. ТгйрегИ., Schlegel Н. Sulfur metabolism in Thiorho- daceae. Quantitative measurement on graving cells of Chromatium okenii H Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. and Serol. 1964. V. 30. № 3. P. 225.
  16. Folch J . Lees M.. Sloan-Stanley G.H.A simple method for the isolation and purification of total lipids from tissue//! Biol. Chem. 1957. V. 226. P. 497-509.
  17. Осипов Г.А., Недорезова Т.П., Ходорковская В.А., Свидин 10.В.Разработка экспресс-системы анализа состава сложных микробных сообществ с использованием масс-спектрометрических методов. Отчет о выполнении НИР по ГНТП “Экологическая безопасность России”. Проект № 7.8.4. 1992.
  18. Rossello-Mora R.A., Caccavo F.Jr., Osterlehner К., Springer N„ Spring S., Schuler D.. Ludwig W.,-Amann R., Vanncanneut M.. Schleifer K.H.Isolation and taxonomic characterization of a halotolerant, facultatively iron-reducing bacterium H Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 569-573.
  19. Steinntuller W., Bock E.Growth of Nitrobacter in the presence of organic metter. 1. Mixotrophic growth // Microbiol. 1976. V. 108. P. 299-304.

Рецензент Л.В. Калакуцкий

Добавить комментарий