ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПИДНОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ВЗВЕСЕЙ T.PALLIDUM И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ БОЛЬНЫХ СИФИЛИСОМ. ДЕТЕКТИРОВАНИЕ ПО СТЕРИНАМ.

Скачать оригинал 

Осипов Г.А.*¹, Аковбян В.А.**, Бойко Н.Б.*, Киселева Г.А.**

*Академическая группа академика РАМН Ю.Ф.Исакова

** Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Минздрава РФ

1 Переписка с этим автором по адресу:

103001,  Москва, Садово-Кудринская, 15

Детская городская клиническая больница им.Н.Ф.Филатова Академическая группа академика РАМН Ю.Ф.Исакова

Тел. /095/ 254 6740; Факс: /095/ 254 1039; Электронная почта: osipovga@rusmedserv.com

Ключевые слова: сифилис, Treponema pallidum, бледная трепонема, диагностика, микробные маркеры, стерины, хромато-масс-спектрометрия.
Резюме. Исследован состав липидной фракции клеточных взвесей T.pallidum, крови и других биологических жидкостей больных сифилисом. В качестве контроля использованы аналогичные данные доноров и соматических больных. Состав жирных кислот и альдегидов спирохеты повторяет состав клеток организма-хозяина. Заметные изменения найдены в метаболитах холестерина, которые могут быть использованы в качестве диагностических признаков. Составлена программа детектирования возбудителя по стеринам в крови и других биологических жидкостях человека методом хромато-масс-спектрометрии в режиме селективных ионов. Концентрации метаболитов оказалась достаточно высокой для диагностики заболевания сифилисом методами газовой или жидкостной хроматографии.

Введение

Система серологической диагностики сифилиса основана на обнаружении в крови антител к возбудителю заболевания — Treponema pallidum [1,6]. Фактически это означает, что с помощью известной лабораторной техники определяется некий продукт, образовавшийся в результате взаимодействия патогена и организма человека. Процесс этот достаточно сложен и мало изучен и зависит как от биологических свойств возбудителя, так и от реактивности организма. До настоящего времени мы не можем дать однозначного объяснения причин феномена серорезистенции и различия в сроках негативации у больных одинаковыми формами сифилиса, получивших однотипное лечение, достоверно определить инфицирование новорожденного от матери, переболевшей сифилисом, и т.д. В значительной степени ответы на эти и многие другие вопросы могли бы быть получены при условии идентификации в крови или других биологических жидкостях человека самого возбудителя или каких-либо специфических компонентов (маркеров). До настоящего времени эта задача представлялясь трудноразрешимой.
В ряде последних сообщений [2-6] достаточно полно отражено общее состояние лабораторной [2] и текущие аспекты клинической диагностики сифилиса [3-6]. Традиционно используемыми методами являются микроскопия в темном поле, метод иммунофлуоресценции [6] и биологический метод (испытание на кроликах) [4], хотя первичную информацию можно получить с помощью простых и недорогих тестов, использующих липидные антигены [2].
Биологический метод очень чувствителен и специфичен, нo требует значительных затрат времени, метод микроскопии нуждается в хорошей технике и высококвалифицированных специалистах (субъективен), а серологический тест недостаточно чувствителен при ранней инфекции.
Для достижения наилучших диагностических результатов необходимо совершенствовать имеющиеся методы и развивать новую технику. Перспективным направлением, использующим молекулярные методы детектирования, является реакция полимеразного связывания (PCR) и лигандного связывания (LCR), которые обладают повышенной чувствительностью обнаружения T.pallidum [3]. Техника PCR успешно использована для для доказательства присутствия Т.pallidum при вторичном и первичном сифилисе [4], когда обычные методы не работают из-за деградации или отсутствия трепонемальной спирохеты на поздней стадии сифилитической язвы. Описан высокочувствительный и специфичный вариант PCR (100 клеток возбудителя) — полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). Чрезвычайно эффективен сложный PCR (M-PCR) — анализ с колориметрическим детектированием для одновременной амплификации ДНК-участков трех микроорганизмов: Haemophylus ducrey, T.pallidum и вируса герпеса в пробах из генитальных органов [8]. Результаты оценки 298 образцов и сравнение их с микроскопическим исследованием, а также результатами культивирования на двух средах показали значительные преимущества данного метода по чувствительности по сравнению с традиционными. Однако сравнение метода флуорecцентных антител и метода PCR на 156 образцах от пациентов с с генитальными язвами показало, что эти методы эквивалентны при выявлении инфекции [9]. Применение перспективного метода твердофазного ферментного иммуноанализа для диагностики раннего сифилиса [10] показало, что он может служить альтернативой традиционным методам, хотя менее чевствителен и специфичен. Заслуживают внимания данные применения антенатального (утробного) сканирования при диагностике материнского сифилиса [11].
Тем не менее, несмотря на обнадеживающие результаты по применению новых перспективных методов и диагностики сложных случаев конгенитального и нейросифилиса [2,4,7,13], разработка экспрессных методов диагностики раннего, вторичного и третичного сифилиса   остается   актуальной   проблемой.   Так,   диагностическая   ценность PCR как возможного альтернативного метода еще недостаточна. Дискутируется также вопрос, сможет ли ферментный иммуноанализ полностью заменить или лишь дополнит существующие традиционные методы [5]. На этом фоне выглядят интересными новые комплексные подходы в диагностике сифилиса на основе высокочувствительного и объективного хроматографического метода исследования [12], а также его комбинации с масс-спектрометрией, который эффективно используется для диагностики других видов инфекции [14,15]. Последний, судя по публикациям, позволяет достичь желаемого результата — определять присутствие самого возбудителя по его специфичным компонентам: химическим составляющим клетки, собственным метаболитам или продуктам взаимодействия с клетками хозяина.
В настоящей работе представлены результаты исследования состава липидной фракции стандартного трепонемного антигена и лиофилизата взвеси бледных трепонем, а также биологических жидкостей (кровь, отделяемое вагины, эякулят, тканевый экссудат клапана сердца) у больных сифилисом, лиц, обратившихся в клиники ЗППП на обследование, соматических больных и доноров.

Материалы и методы. 

Исследованы три препарата клеточных компонентов T.pallidum.
Препарат ТР-1. Взвесь в физиологическом растворе свежеполученных клеток спирохет из семенников инфицированного кролика.
Препарат ТР-2. Лиофилизат патогенных бледных трепонем штамма Никольса.
Препарат ТР-3. Лиофилизированный стандартный антиген спирохет, полученный на искусственной среде в заводских условиях (Ставрополь).
Исследован состав липидных компонентов — жирных кислот, спиртов, альдегидов и стеринов крови больных сифилисом, а также других биологических жидкостей пациентов, обратившихся в клинику ЗППП на обследование. В качестве контроля использованы данные анализа аналогичных биологических жидкостей пациентов гинеколога и уролога, соматических больных и доноров. Список проб приведен в табл.2.
Проба водной клеточной взвеси T.Pallidum стерилизована добавлением 2мл метанола перед напрвлением на анализ. Далее добавлен хлороформ до соотношения монофазной системы растворителей вода:метанол:хлороформ=1:1:0.9, применяемой для экстракции липидов. Экстракцию проводили в течение трех часов при периодическом инициировании на вибраторе Vortex. Затем добавляли воду и хлороформ до разделения фаз, двухфазную систему центрифугировали, нижнюю фазу (хлороформ) переносили пипеткой в чистые пробирки, упаривали досуха в токе инертного газа. Полученный таким образом экстракт липидов подвергали кислому метанолизу в 1N HCl в метаноле. Метанолиз проводили в 0.4 мл реактива течение часа при 80°С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов. Липидную фракцию из реакционной смеси двукратно экстрагировали гексаном, высушивали и обрабатывали 20 мкл N,О-бис(триметил-силил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 65 °С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот. Реакционную смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра системы Микробиологический анализатор «Маэстро». Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке. Для идентификации и количественного анализа компонентов проб использовали масс-спектрометр в режиме сканирования или масс- фрагментографии (МФ), при отработке диагностики Т.pallidum по выявленным маркерным веществам. Для этого введены дополнения в программу масс-фрагментографии, используемой для определения микробных маркеров в крови и других биологических жидкостях [15]. Интервалы и ионы выбирали таким образом, чтобы селективно детектировать эти маркеры на превалирующем фоне липидных компонентов субстрата. В качестве репера при количественных измерениях использована величина хроматографического пика гептадекановой кислоты, содержание которой постоянно в биологических жидкостях млекопитающих и составляет, по нашим измерениям, 20мкг/мл.

Результаты и обсуждение. 

Анализ липидной фракции экстрактов из препаратов спирохет показал, что их жирнокислотный профиль составляют в основном четные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, характерные для клеток млекопитающих (табл.1). Сравнение с составом ЖК крови человека показывает качественное совпадение данных, что cогласуется с известными данными об отсутствии у T.pallidum собственного аппарата синтеза липидов и их заимствованию из клеток хозяина [15]. Cостав жирных кислот патогенных трепонем штамма Никольса (ТР-1), извлеченного из семенников кролика, а также лиофилизата очищенного антигена, полученного лабораторным (ТР-2) и заводским (ТР-3) способами. одинаков. Изолят ТР-1 отличается большим содержанием холестерина и наличием полиненасыщенных кислот с числом атомов углерода 20 и 22, так как эта проба включает экссудат ткани кролика. Кроме холестерина в нем содержатся четыре метаболита, синтез которых может быть индуцирован под влиянием возбудителя. Три из них идентифицированы по масс-спектрам как кампестерол, ситостерол и этилкопростанол. Все новые стерины имеют специфические масс-спектры, удобные для их детектирования. Кроме них в клетках и взвесях спирохет не обнаружено других липидных компонентов, которые могли бы служить маркерами возбудителя на фоне биологических жидкостей человека.
Таблица 1.
Состав жирных кислот (% от суммы) препаратов антигена T.pallidum и крови человека

Экстракты липидной фракции крови и других биологических жидкостей больных сифилисом и здоровых доноров также совпадают по составу жирных кислот, но отличаются наличием у больных дополнительных метаболитов холестерина которые, видимо, принадлежат продуктам взаимодействия клеток хозяина с возбудителем  (интерактивные  метаболиты). Среди них два, ситостерол и кампестерол, являются общими с метаболитами инфицированного T.pallidum кролика. Два оставшихся характерны только для человека. Один из них — тетраметилхолестерин, другой пока не идентифицирован, несмотря на использование самой последней библиотеки масс-спектров (78000 спектров) и сведений из периодической литературы. Для него будем использовать условное название “стерин 428”. Все стерины имеют четкие особенности масс-спектров, которые могут быть использованы при их детектировании методом ГХ-МС селективных ионов.
Три вещества 4b-метилхолестерол (кампестерол), b-ситостерол, и неизвестный М=428 выбраны для оценки диагностической значимости. Анализ проб биологических жидкостей проведен по модифицированнй программе масс-фрагментографии, используемой для определения микробных маркеров в крови и других биологических жидкостях [15]. Результаты приведены в таблице 2.
Как видно из этой таблицы и трехмерной диаграммы (рис.2), концентрация трех маркеров в пробах больных и лиц из групп риска значительно выше, чем у доноров и соматических больных.
Таблица 2.
Содержание избранных метаболитов холестерина у пациентов разных категорий и доноров.

* У кролика отсутствует метаболит 428, данные приведены по этилкопростанолу
Из данных таблицы следует, что предполагаемые маркеры присутствуют во всех исследованных пробах, в том числе и у практически здоровых людей.  Повидимому,  в  обычных условиях в клетках организма человека происходит синтез кампестерола, ситостерола и стерина-428, но количество их невелико. У больных сифилисом или экспериментально зараженных животных (в случае заведомого присутствия в организме бледных трепонем) концентрация этих стеринов в биологических жидкостях существенно увеличивается. Этот уровень повышается от минимальной концентрации у доноров до средних значений у лиц из группы риска заражения ЗППП и достигает максимума у больных сифилисом и экспериментальных животных. Причем в препаратах спирохет эти вещества отсутствуют, что свидетельствует об отсутствии их синтеза вне контакта с организмом хозяина. собственно, это является известным фактом, так как бактерии не способны синтезировать стерины.

Рис. Распределение стеринов – предполагаемых маркеров бледной трепонемы в биологических жидкостях больных разных категорий и доноров.
Таким образом, установлен факт увеличения образования трех описываемых стеринов в биологических жидкостях человека и экспериментального животного в присутствии бледных трепонем. Необходимы дальнейшие исследования с целью возможного использования данного явления для обнаружения возбудителя в организме человека.
Приведенные примеры показывают, что использованный метод позволяет проводить специфический количественный анализ микробных маркеров в крови и биологических жидкостей здоровых и больных людей и надежно фиксировать разницу их концентраций. В отличие от других известных способов диагностики ГХ-МС-МФ метод не требует прекультивирования пробы, а также использования специфического биологического тестового материала: ферментов, сывороток, меток, праймеров, питательных сред, экспериментальных животных и т.п. В анализе используются химические реактивы и аппаратура, общеупотребимая при хромато-масс-спектрометрическом рутинном анализе.
На данной стадии заболевания возможно использование для диагностики хроматографа с обычным детектором (ионизации в пламени), так как концентрации диагностических  стеринов достаточно велики и в их области на хроматограмме нет мешающего фона. Повидимому, можно применить и жидкостную хроматографию.

Выводы.

Образцы трех исследованных препаратов T.pallidum имеют одинаковый жирнокислотный состав, что свидетельствует об их видовой идентичности.
Обнаружены интерактивные метаболиты — стерины, которые могут быть использованы для детектирования трепонем в биологических жидкостях человека.
Целесообразно проведение дополнительных исследований проб биологических жидкостей больных сифилисом для разработки метода ранней диагностики заболевания методами хромато-масс-спектрометрии, а также газовой и жидкостной хроматографии.

Благодарности.

Авторы выражают благодарность канд.мед.наук Соколову Я.А. за предоставление биологических проб и канд.хим.наук Деминой А.М. за составление реферата по методам диагностики сифилиса.

Литература.

1. Syphylis. Атлас (США).
2. Larsen  S.A, Steiner  B.M.,  Rudolph  A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin.Microb.Rev. 1995, 8(1), 1-21.
3. Quinn T.C. Recent advances in diagnosis of sexually transmitted diseases. Sex.Transm.Dis. 1994, 21(2 Suppl), 19-27.
4. Zoechling N., Schluepen E.M., Soyer H.P., Kerl H., Volkenand M. Molecular detection of Treponema pallidum in secondary and tertiary syphilis. Br.J.Dermatol. 1997, 136(5), 683-686.
5. Hagedorn H.J. Current aspects in the diagnosis of syphilis. Immun.Infekt. 1993, 21(4), 94-99. Rawstron S.A., Vetrano J., Tannis G., Bromberg K. Congenital syphilis: detection of Treponema pallidum in stillborns. Clin.Infect.Dis. 1997, 24(1), 24-27.
6. Centurion-Lara A., Castro C., Shaffer J.M., Van Voorhis W.C., Marra C.M., Lukehart S.A. Detection of Treponema pallidum by a sensitive reverse transcriptase PCR. J.Clin.Microbiol. 1997, 35(6), 1348-1352.
7. Orle K.A., Gates C.A., Martin D.H., Body B.A., Weiss J.B. Simultaneous PCR detection of Haemophilus ducreyi, treponema pallidum, and herpes simplex virus types 1 and 2 from genital ulcers. J.Clin.Microbiol. 1996, 34(1), 49-54.
8. Jethwa H.S., Schmitz J.L., Dallabetta G., Bechets F., Hoffman I., Hamilton H., Lule G., Cohen  M., Folds J.D. Comparison of molecular and microscopic techniques for detection of Treponema pallidum in genital ulcers. J.Clin.Microbiol. 1995, 33(1), 180-183.
9. Cummings M.C., Lukehart S.A., Marra C., Smith B.L., Shaffer J., Demeo L.R., Castro C., McCormack W.M. Comparison of methods for the detection of Treponema pallidum in lesions of early syphilis. Sex.Transm.Dis. 1996, 23(5), 336-369.
10. Garland S.M., Kelly V.N. Is antenatal screening for syphilis worth while? Med.J.Aust. 1989, 151(1), 368.
11. Schmidt B.L. The use of high-pressure liquid chromatography in syphilis serodiagnosis.
12. Wien.Med.Wochenschr. 1982, 132(22), 547-550.
13. Wicher K., Noordhoek G.T., Abbruscato F., Wicher V. Detection of Treponema pallidum in early syphilis by DNA amplification. J.Clin.Microbiol. 1992, 30(2), 497-500.
14. Sud I.J., Feingold D.S. Detection of 3-hydroxy fatty acids of picogram levels in biologic specimens. A chemical method for the detection of Neisseria gonorrhoeae? The Journal of Investigative Dermatology. 1979,v.73,p.521-526.
15. Осипов Г.А. Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах. //Вестник РАМН. -1996, Т.13,-№2,- С.15-27.
16. Cohen P.G. et al. Cellular fatty acids of treponemes. Br.J.Vener.Dis., 1970 Feb.,46(1), 10-12.