КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА КУЛЬТУРАЛЬНО-БИОХИМИЧЕСКИМ И ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ

  • Главная
  • Статьи

В организме человека  обитает более 500 видов микробов. Их общая численность составляет 1014 , что в 10 раз превышает число клеток человека. Большая часть микробов в количестве 1-2 кг сосредоточена в кишечнике [Luckey, 1987]. Понятно, что традиционные методы исследования 10 -15 видов микрофлоры фекалий не в состоянии отразить реальную картину качественного и количественного состава микрофлоры кишечника.
Развитие в последнее десятилетие молекулярных методов микробиологических исследований дает возможность расширить сведения о видовом составе микробиоты кишечника.  Молекулярно-генетический метод гибридизации 16S rРНК [Hopkins, 2001], в том числе в сочетании с градиентным гель-электрофорезом (DGGE) денатурированных ПЦР-фрагментов (ампликонов) rДНК   [Favier, 2002] применен для контроля бактериальных групп и отдельных видов бактерий (до 18 таксонов) в фекалиях. Метод видоспецифичен, но трудоемок и малодоступен ввиду необходимости индивидуального подбора тестовых олигонуклеотидов для каждой реакции амплификации, либо процедуры клонирования неспецифичных ПЦР-продуктов с последующим секвенированием очищенных плазмид. Тем не менее, ПЦР-DGGE при наличии необходимых стандартов предлагается для мониторинга микроорганизмов в фекалиях.
Метод детектирования микроорганизмов по нелетучим жирным кислотам (ЖК) клеточной стенки микроорганизмов методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС)  сродни генетическому, поскольку состав ЖК детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего  синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК (Албертс, 1986). Поэтому профиль ЖК бактерий является их визитной карточкой или фингерпринтом, как отпечатки пальцев людей (Митрука, 1978). Он так же консервативен, как строение ДНК, но и так же подвержен мутациям под действием факторов окружающей среды. Стабильность набора жирных кислот, составляющих клетки микробов, подтверждается исследованиями в области бактериальной палеонтологии, которые показывают, что до глубины времен в 2,5 млрд лет состав ЖК отдельных  микробов и пула их жирных кислот в целом остается постоянным (Шеховцова, 2002).  В отличие от молекулярно-генетического этот метод позволяют  быстро получить количественную информацию о большом спектре микроорганизмов [Lehtonen, 1995; Chemical Methods.., 1994; Stead, 1992]. Метод основан на использовании очень больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов. Особенности состава жирных кислот теперь используются наряду с другими параметрами в бактериальной таксономии [Определитель бактерий.., 1997] и клинической бактериальной диагностике [Вейант, 1999]. Фирмой MIDI Inc., Делавер, США серийно выпускается хроматограф Microbial Identification System для автоматической идентификации микроорганизмов по составу ЖК чистой культуры клеток, выращенной в стандартных условиях [Stead, 1992].
Ранее нами описаны примеры обнаружения микроорганизмов при инфекционных процессах методом ГХ-МС [Осипов, Демина, 1996].  Установлено наличие гомеостаза малых молекул микробного происхождения в крови человека, который нарушается при воспалениях [Белобородова, Осипов, 1999; Beloborodova, Osipov, 2000 ].
Микробиота тонкого кишечника в гастроэнтерологии исследуется крайне редко, в основном при хирургическом вмешательстве. При этом определяют в основном ограниченный круг условно-патогенных микроорганизмов культурально-биохимическим методом в аэробных условиях. Чаще изменения нормальной микробиоты кишечника определяют по составу микроорганизмов в фекалиях. Однако, для оценки дисбиоза более ценной является информация о микробной колонизации в стенке кишечника, которая обеспечивается адгезивными свойствами бактерий. В отличие от микрофлоры фекалий, именно эти микроорганизмы наиболее точно отражают состояние микробной экологии человека [Шендеров, 1998]. Микрофлора, обладающая адгезивными свойствами, является наиболее жизнеспособной. Она сосредоточена на апикальной мембране энтеро- и колоноцитов, т.е. в зоне ассимиляции нутриентов. Можно предполагать, что изменения ее качественного и количественного состава оказывают влияние на пищеварительно-транспортные процессы в тонкой кишке. Недавно были опубликованы результаты анализа специфических для микроорганизмов длиноцепочечных клеточных жирных кислот (ЖК) в биоптатах стенки тонкой, подвздошной и ободочной кишок (Осипов, 2001, Парфенов, 2001). Методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии определены ЖК из состава клеточной мембраны и липополисахарида микроорганизмов в биоптатах, полученных во время интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией, у пациентов с синдромом раздраженного кишечника (СРК) и здоровых добровольцев. Одновременно кровь пациентов с СРК исследована на содержание 135 таких веществ, что дает информацию о 170 таксонах микроорганизмов. На основании этих данных рассчитан  состав пристеночной микробиоты разных отделов кишечника в сопоставлении с фекалиями и показана адекватность изменения микробных маркеров в крови при СРК.
Предлагаемя работа является продолжением этих исследований и содержит сведения о ряде новых родов микроорганизмов, включенных в алгоритм мониторинга в связи появлением данных по составу их жирных кислот и альдегидов. Эти сведения существенно расширяют возможности клинического приложения метода, так как дополняют результаты информацией по клостридиям, представителям рода Eubacterium, пропионобактериям и руминококкам. Кроме того, при посеве материала биоптатов на питательные среды подтверждено наличие в составе пристеночной микробиоты кишечника выделением в чистой культуре ряда батерий, грибов и аэробных актиномицетов, определенных ранее по жирнокислотным маркерам. В связи с этим внесены коррективы в определение клинического значения изменений состава пристеночной микрофлоры кишечника человека при СРК и антибиотико-ассоциированной диарее (ААД).

Материал и методы исследования

Обследованы 31 больной с синдромом раздраженного кишечника  с преобладанием поносов, 18 больных с урогенитальной инфекцией (15 чел), обострением хронического бронхита и очаговой правосторонней пневмонии (3), у которых лечение осложнилось антибиотикоассоциированной диареей и 3 больных болезнью Крона тонкой кишки. Контрольную группу составили 3 добровольца из числа призывников на военную службу.
Исследовали пробы крови и биоптаты слизистой оболочки тощей, подвздошной и ободочной кишок. Биоптаты (1-2 фрагмента слизистой оболочки общим весом до 8 мг) получали во время интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией.
Для верификации метода – то есть для определения соотношения измеряемых концентраций микроорганизмов с данными измерений культуральным и молекулярно-генетическим методами проведено измерение состава фекалий здорового человека.
Принцип метода — молекулярный, основан на прямом определении в биопробе жирных кислот (ЖК) клеточной стенки микроорганизмов. Известно, что 200 микробных ЖК специфичны и обеспечивают определение состава микробиоты слизистых оболочек и очагов воспаленя на преобладающем фоне 20 человеческих ЖК. Метод ГХ-МС и программа расчета обеспечивают количественный мониторинг микробиоты. База данных содержит сведения о профилях ЖК более 1000 видов  бактерий, грибов и актиномицетов.
Подготовка пробы и условия культивирования микроорганизмов биоптатов. Биоптаты из стерильных пробирок, в которые производился их отбор при зондировании кишечника, асептически переносили в стерильную фарфоровую ступку и растирали с добавлением стерильной дистиллированной воды. Растертые биоптаты количественно переносили в пробирки с дистиллированной водой. Из разведений 10-4 – 10-5 производили посевы суспензий на РПА, РПА 1:10, кровяной агар, bile salt agar, yeast extract agar, starch agar. Чистые культуры микроорганизмов получали путем пересевов при контроле методом световой микроскопии. При анализе анаэробной составляющей кишечной микробиоты пробу сразу после извлечения зонда переносили в пробирку с угольной транспортной средой для анаэробов (фирма) и немедленно доставляли в бактериологическую лабораторию, где проводили посев в пробирку в толщу агаризованных сред или во флаконы BACTEK для анаэробов.  Из толщи агаризованных сред колонии вырезали, а взвесь клеток из жидкой среды предварительно центрифугировали. И то и другое подвергали кислому метанолизу после подсушивания вместе с остатками среды. Цельную кровь в количестве 0,05 мл высушивали при добавлении метанола и подвергали кислому метанолизу в  0,4 мл 1 М HCl в метаноле.
Газовая хроматография — масс-спектрометрия. Метанолиз биоптатов слизистой оболочки в количестве 3-4 мг, проводили в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение одного часа при 80°С. В результате реакции метанолиза сложных липидов жирные кислоты освобождаются в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы HP-5973 Аджилент технолоджис (США).  Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Аджилент технолоджис. Режим анализа и обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам осуществляли как описано ранее [Осипов, Парфенов, 2001].
Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе с использованием внутреннего стандарта. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. Для количественного расчета использовали данные калибровки по дейтерированной тридекановой кислоте и чистым культурам клинических изолятов микроорганизмов.
Идентификация микроорганизмов. В изолятах и анаэробных накопительных культурах определение вида микроорганизмов проводили на Microbial Identification System (MIDI. Inc., Newark, Del.). Изоляты идентифицировали по коммерческой базе данных (MIDI, Inc.) объемом 1800 штаммов, а также с использованием собственной базы данных, включающей около 800 штаммов бактерий, аэробных актиномицетов и микроскопических грибов. ГХ-МС использовали для подтверждения данных хроматографии,  идентификации неизвестных компонентов и анализа отдельных колоний, когда количество микроорганизмов оказывалось не достаточным для анализа на ГХ. Морфологию выделенных штаммов контролировали методом световой микроскопии окрашенных препаратов и методом сканирующей электронной микроскопии.

Расчет состава и количества эффективных клеток микроорганизмов.

 Площадь хроматографического пика маркера пропорциональна его концентрации а следовательно, концентрации соответствующего микроорганизма, которая определяется как число клеток N1 в единице объема или веса пробы по формуле:
N1=Ai[Mst/(q2*Msam*Ast)]/Ri1  , где выражение в квадратных скобках, постоянный коэффициент
к = Mst/q2/Msam/Ast = Mst(мг)/5,1×10(-15)г/Msam(мг)/Ast
В этих формулах Ai — площадь пика маркера, Mst — количество введенного в пробу стандарта в мг, Msam — соответственно, количество пробы, Ast — площадь пика стандарта, Ri1 — доля в % маркера с индексом i в профиле ЖК определяемого микроба с номером 1 (N1), q2 — коэффициент, равный 5,1×10(-15)г , в котором содержится основополагающая в пересчете на число клеток величина 5,9х1012 клеток микробов, содержащихся в 1г микробной биомассы и доля ЖК в клетке, принятая в среднем равной 3%.
Соответственно, число клеток любого следующего микроорганизма можно рассчитать по аналогичной формуле N2 = Ai x k / Riи так далее, умножая площади пика  Ai маркера, по которому проводятся вычисления, на  коэффициент k и деля на долю маркера в % в составе ЖК этого микроорганизма.
Таким способом определяли эффективную (то есть соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность бактерий видов Сl. perfringens, Cl. difficile, Prevotella, Stenotrophomonas грибов Candida albicans, бактерий родов Klebsiella, Eubacterium, Rhodococcus, Nocardia, Sphingobacterium, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, сем. Enterobacteriaceae и других, а также неспецифически грибов по эргостеролу (Aspergillus, Mucor и др.). Некоторые бактерии и вирусы вмешиваются в синтез стеринов в клетках человека, что позволяет определять бактерии рода Eubacterium  по продукту трансформации человеческого холестерина ее ферментом в копростанол, вирусы герпеса неспецифически по индуцируемому ими метаболиту холестендиолу, цитомегаловирусы — по холестодиенону и изомерам холестадиена. Если вещество не обладает свойством маркера, то есть может быть отнесено к двум или более таксонам, то и в этом случае доля вклада каждого микроорганизма, если воспользоваться решением системы уравнений для двух (или, соответственно, более) веществ. Такой способ описан нами для расчета экологических микробных сообществ [Турова, Осипов, 1996], при котором видовой состав микробного сообщества  в общем виде для m веществ хроматограммы и n родов (видов) микроорганизмов можно вычислить, составив систему из m уравнений для n неизвестных:
А1. k = N1R1,1 + N2R1,2 + N3 R1,3 +………+  NnR1,n
                А2. k = N1R2,1 + N2R2,2 + N3R2,3 +………+  NnR2,n
А3. k = N1R3,1 + N2R3,2 + N3R3,3 +………+NnR3,n   
Аm. k = N1Rm,1 + N2Rm,2 + N3Rm,3 +………+  NnRm,n
где  Ai (i=1,2….m) — площадь пика,
Nj (j=1,2…n) — число клеток микроорганизмов,
k — коэффициент пропорциональности,
Rij — доля i-того вещества в профиле ЖК j-того микроба.

Результаты и обсуждение

Состав и численность пристеночной микробиоты кишечника в сопоставлении с фекалиями.
Описанным выше методом определена заселенность слизистой оболочки кишечника (табл. 1), которая  оказалась у здоровых людей по порядку величины одинаковой для тощей, подвздошной и толстой кишок  (0,6 — 1) ´ 1011 кл/г и существенно меньше по сравнению с фекалиями (2,7´ 1011 кл/г).   Полученная численность для фекалий находится в пределах интервала значений 1011— 1012 кл/г, известных из литературных данных (Маянский, Микробиология для врачей, 1999). Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по нашим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений, в пределах 3-6 порядков. Тем не менее, совпадает наша оценка о приоритете рода Eubacterium, численность которых имеет порядок  1011 кл/г (109 – 1012 по литературным данным),  о количестве бактероидов 1010 кл/г (1010 — 1012 по известным данным), клостридий — 6 х 1010 кл/г (105 — 1011 соответственно), бифидобактерий 1010 кл/г (1010 — 1012), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам  и стафилококкам. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными приводимые здесь сведения о составе микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки.
Таблица 1.
Состав микроорганизмов стенки кишечника и в фекалиях по группам

Группы и таксоны микроорганизмовЧисленность, кл/г, ´106
 
ТощаяПодвздошнаяОбодочнаяФекалии
Кокки, бациллы, коринебактерии
Streptococcus26125311701691
Bacillus cereus051157284
Bacillus megaterium90000
Corineform(Listeria) а17139843971365
Staphylococcus616410490121
Streptococcus16421272641
Сумма4006128125332803
Анаэробы
Eubacterium lentum986756704334
Clostridium hystolyticum692467849388
Peptostreptococcus anaerobius48733042337
Clostridium propionicum1237150013942
Bacteroides hypermegas000163
Clostridium ramosum389219421180
Fusobacterium/Haemophylus000129
Porphyromonas00039
Lactobacillus17355171901623130510
Eubacterium moniliforme000892
Cl.difficile17698611055684
Prevotella6205833457557
Eubacterium/Enterococcus6832114972445712026
Bacteroides fragilis063431340
Bifidobacterium524971083188610723
Clostridium perfringens224504344698
Eubacterium271548354993218
Eubacterium sp127771057130863648
Propionibacterium acnes00359388
Ruminicoccus804800136430
E.lentum  774193560282
Bacteroides ruminicola0792769
Eubacterium spp.36526556509725
Propionibacterium000698
Сумма5252044648100138238219
Аэробные актиномицеты
Nocardia, 14:1d111595011367
Актиномицеты7972891050
Pseudonocardia21578534
Streptomyces4933923291522
Rhodococcus1588792698127
Mycobacterium/Candida3025318432570
Actinomadura1510120
Nocardia asteroides17820609108
Actinomycetes 10Me1436523196232892
Сумма13297785985581891
Грам (-) палочки
Acinetobacter000125
Pseudomonas aeruginosa00042
Stenotrophomonas maltophilia00024
Сумма000191
Энтеробактерии и энтерококки
Klebsiella 2h1414626119084
Campylobacter mucosalis00018
E.coli2021250
Helicobacter pylory, h18529141922134
Enterococcus7834841252669
Enterococcus faecalis005304649
Сумма147890720897554
Микроскопические грибы
Микр грибы (кампестерол)2163751121430
Микр грибы (ситостерол)19742256888
Микр грибы (эргостерол)000286
Сумма4137971682604
Вирусы
Herpes2161132030
Цитомегаловирус91931268
Сумма11351442308
Не  идентифицированы
Маркер i1408409215192
Маркер i173066154902061
Сумма306623899217253
Общая сумма7591557772112637270523

По данным табл. 1 общая удельная численность микроорганизмов в пристеночном слое ободочной кишки (далее будем говорить просто в ободочной или другой кишке, имея в виду биоптат кишечной стенки вместе с мукозным слоем) в два с половиной раза меньше, чем в фекалиях, но доля анаэробов так же  составляет 89%. Однако родовой состав внутри группы анаэробов иной, чем в фекалиях. На стенке больше втрое концентрация бифидобактерий, но меньше лактобацилл и эубактерий. Причем у последних изменен и видовой состав по сравнению с фекальным. Интересно отметить, что концентрация C.perfringens на три порядка меньше в пристеночном слое как ободочной, так и подвздошной кишки, чем в фекалиях, но снова увеличивается в тощей. Это означает практически, что фекалии являются основным местообитанием  этих бактерий, а также С.propionicum. Другие клостридии, C.hystolyticum и C.difficile сохраняют порядок величины по отделам кишечника и в фекалиях (около 103), а C.ramosum не обнаруживается в фекалиях, но ее численность ратет от 108 в ободочной до 109 в тощей кишке. Следующей по численности группой  в фекалиях являются факультативные анаэробы – энтеробактерии и энтерококки, в основном, за счет E.faecalis, который не обнаруживается в подвздошной и тощей кишках, тогда как прочие энтерококки, хеликобактер и клебсиеллы равномерно заселяют кишечник и фекалии. E.coli и другие бактерии сем. Entrobacteriaceae в норме обнаруживаются методом ГХ-МС только в кишечной стенке, а Campylobacter mucosalis – только в фекалиях.
Существенную долю микробиоты тощей кишки (1,3х 1010 кл/г, в фекалиях – на порядок меньше) составляют аэробные актиномицеты. В предыдущей работе, при неполном учете анаэробов, их доля оказалась относительно завышенной – около 50% вместо 17% по данным табл 1. В специализированных лабораториях подтверждено их наличие на слизистых оболочках и коже человека и животных, а также их участие в воспалительных процессах. Они не доступны рутинному контролю в рядовых клинических лабораториях, однако, благодаря наличию уникальных молекулярных маркеров могут быть обнаружены и количественно измерены методом масс-спектрометрии. Далее по численности следуют аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки и коринеформные бактерии) – около 5% в тощей кишке и 1% в фекалиях.
Плотность заселения стенки кишечника в дистальном направлении  меняется мало: в подвздошной кишке она в два раза меньше, а в толстой в полтора раза больше, чем в тощей. Измеренная нами пристеночная микрофлора оказалась существенно более концентрированной, чем просветная (по литературным данным (Маянский, Микробиология для врачей, 1999), , которая в тонкой кишке на шесть порядков ниже по численности (до 105 кл/мл,), в подвздошной кишке – на порядок выше.
Неожиданным результатом, несомненно, является обнаружение значительного количества аэробных актиномицетов. Специфичность их маркеров — разветвленных жирных кислот с метильной группой в положении Δ10 не позволяет предполагать какие-либо иные таксономические группы микроорганизмов, кроме представителей порядка Actinomycetales, содержащих в составе клеточной стенки миколовые кислоты, являющиеся источником 10-метилразветвленных ЖК. Они содержаться в микобактериях, нокардиях, родокках, Actinomadura spp. и других актиномицетах, но не найдены у высших органзмов (в грибах, растениях, животных). Присутствие этих молекул в биоптатах кишечника, крови и других органах и жидкостях человека подтверждается масс-спектрами в хроматографическом пике и относительным хроматографическим  временем удерживания, а также их анализом в составе музейных культур соответствующих микроорганизмов. Бактерии родов Streptomyces и Nocardiopsis подтверждены также уникальным маркером изо-гексадекановой кислотой (i16). Кроме того, профиль разветвленных ЖК специфичных для стрептомицетов выявлен в крови септических больных в нашей практике, а Nocardiopsis dassonvilley  выделен в чистой культуре из кишечника в настоящем исследовании. Список актиномицетов на самом деле шире, чем это показано в первой группе табл. 7. Сюда следует добавить анаэробные актиномицеты и близкие к ним микроорганизмы. Это Propionibacterium, Actinomyces, Brevibacterium, которые также выделены в чистой культуре и коринеформные бактерии. Наконец, если учесть, что до настоящего времени в некоторых руководствах по микробиологии, как и ранее [Определитель бактерий.., 1997], род Bifidobacterium относят к семейству Actinomycetaceae, то окажется, что актиномицеты занимают существенное место в пристеночной микробиоте кишечника. Такая оценка повышает значимость микробиоты кишечника для организма хозяина, так как актиномицеты превосходят все прочие микроорганизмы по продукции антибиотиков и витаминов и обладают мощным ферментативным аппаратом. Высокая степень колонизации кишечника актиномицетами не выглядит необычным явлением, если иметь в виду, что актиномицеты широко распространены в окружающей среде – почве, воде,  воздухе, на внутренних стенах жилых и производственных помещений. Их обитание в организме человека при таких обстоятельствах выглядит естественным.  Действительно, в руководствах по клинической микробиологии отмечается обнаружение актиномицетов и родственных организмов, таких как Mycobacterium, Actinomadura, Propionibacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Bifidobacterium в кишечнике и других органах человека. Там они известны (в том числе и бифидобактерии) как участники инфекционных и воспалительных процессов. Однако эти проявления актиномицетов (патогенность, чувствительность к антибиотикам, способы лечения) являются предметом  единичных специализированных лабораторий и клиник в мире. Трудности в их бактериальной диагностике и культивировании послужили препятствием широкой известности этих микроорганизмов в клинической практике. В том числе при многочисленных заболеваниях, связанных с изменением микробиоты кишечника.
При периодическом посеве биоптатов разных пациентов на питательные среды в аэробных условиях было выделено 52 штамма бактерий, аэробных актиномицетов, дрожжей и грибов. По данным световой и электронной микроскопии колоний, биохимическим тестам, профилям жирных кислот при подтверждении идентификации методом ГХ-МС выявлено 27 таксонов на уровне рода или вида (в скобках — число видов):
Таблица 2
Перечень родов микроорганизмов, выделенных в чистом виде и идентифицированных при посеве биоптатов кишечника на питательные среды ( в скобках  — число видов, если больше одного)

•             Acinetobacter
•             Actinomyces
•             Alcaligenes
•             Aspergillus
•             Bacillus (8)
•             Bacteroides
•             Bifidobacterium
•             Brevibacterium
•             Campylobacter
 
•             Candida (2)
•             Chriseobacterium
•             Citrobacter
•             Comamonas
•             Enterococcus
•             Enterobacter
•             Helicobacter
•             Lactobacillus
•             Leiconostoc
 
•             Nocardiopsis
•             Ochrobactrum
•             Penicillum
•             Peptostreptococcus
•             Propionibacterium
•             Pseudomonas (3)
•             Proteus
•             Stenotrophomonas
•             Streptococcus
 

Идентификация проведена по профилям клеточных жирных кислот. Часть изолятов идентифицировали для проверки культурально-биохимическим методом (табл. 3)
Таблица  3
Сопоставление данных идентификации микроорганизмов кишечной стенки культурально — биохимическим и хроматографическим методами

Штамм ГХ-система ШерлокБиохимический метод
Pseudomonas stutzeriP.aeruginosa
3BStenotrophomonas maltophiliaS.maltophilia
2BProteus mirabilisEnterobacter cloacae
3AChriseobacterium meningosepticumCh.meningosepticum
1B Enterobacteriacea spsE.cloacae
4ABacillus atrophacusГрам+ палочки
1AAlcaligenes xylosooxydansAlcaligenes faecalis
3COchrobactrum anthropiiO. anthropii

Микрофотографии приведены на рис 1(микроскопический гриб) и 2 (актиномицет Nocardiopsis dassonvillei).

Рис 1. Микрофотография гриба из пристеночного слоя кишечника. Сканирующий электронный микроскоп.

Рис 2. Микрофотография двух колоний аэробного актиномицета Nocardiopsis dassonvillei из пристеночного слоя кишечника. Сканирующий электронный микроскоп.
В таблицу 2 включены два представителя анаэробной микрофлоры: Peptostreptococcus anaerobius, выделенный в анаэростате и Actinomyces viscosus, выявленный в накопительной культуре при посеве в бутылочки BACTEC на среду для анаэробов. Эти организмы определены методом ГХ-МС по составу ЖК. Обнаружены маркеры бактерий группы Bacteroides fragilis (3hi17, 3h16 и i15) и лактобацилл (16:1 DMA и 19cyc 11,12). Им сопутствуют аэробы  Stenotrophomonas (маркер i11:0), Eikenella (предполагается по паре маркеров 3h10 и 3h12 при отсутствии 2h12), и представители семейства Enterobacteriaceae, судя по одновременному присутствию их известных маркеров: β-оксимиристиновой кислоты (3h14), цис-вакценовой (18:1w7) и циклогептадекановой кислоте (17cyc). В другой пробе удалось выявить Propionibacterium avidum по профилю разветвленных жирных кислот – этот микроб был выделен и при посеве в аэробных условиях, поскольку является аэротолерантным организмом. Основная часть профиля жирных кислот этой пробы (прямоцепочечные ЖК) наиболее близка к Pseudomonas alcaligenes.

Изменение микрофлоры тонкой кишки при ААД

У 17 больных ААД исследованы 50 микроорганизмов, концентрация которых определена по молекулярным маркерам непосредственно в биоптате слизистой оболочки кишки (табл 4). Существенные (более, чем в два раза) отклонения в численности колонизации претерпевают многие  микроорганизмы — 13 из 55 контролируемых. Особенно часто увеличивается концентрация Streptococcus (14 из 17), Eubacterium lentum (12), Bacillus cereus 12), Acinetobacter (10), Pseudomonas aeruginosa (12), Campylobacter mucosalis (12), Eubacterium/Enterococcus (11), Bacteroides fragilis (10), Eubacterium (10), Propionibacterium acnes (15) и микросокопических грибов (10), продуцирующих ситостерол и кампестерол. Увеличение  численности Cl. difficile не наблюдалось. Но обнаруживали превышение нормы колонизации Cl. Perfringens (6 из 17) и Cl. propionicum (5 из 17). Однако, основной тенденцией синдрома является уменьшение численности большинства микроорганизмов, — 25 из 55 контролируемых более чем в 50% случаев. Регулярно уменьшалась численность анаэробного пептострептококка, большинства видов эубактерий, энтеробактерий и аэробных актиномицетов. Отсюда следует, что причиной ААД является не определенный инфекционный агент, в частности, Cl. difficile, а скорее неспецифическое изменение нормальной микрофлоры тощей кишки. Такая ситуация представляется более правдоподобной по сравнению с моноэтиологичным вариантом. Действительно, пациенты принимали различные антибиотики и трудно представить, что у всех оказывался резистентным только один оппортунистический микроорганизм — Cl.difficile.
Таблица 4
Количество случаев более чем двукратного превышения нормы (>2N) численности микроорганизмов в тонком кишечнике и соответственно ее уменьшения более чем вдвое (<0,5N) при СРК и ААД

ААД (n=17)СРК (n=30)
Микроорганизм>2N<0.5N>2N<0.5N
1Streptococcus1423
2Eubacterium lentum, i16a1223
3Bacillus cereus1219
4Баланс50110
5Clostridium hystolyticum215326
6Nocardia, 14:1d11411720
7Peptostreptococcus anaerobius017130
8Acinetobacter100180
9Pseudomonas aeruginosa120220
10Propionibacterium2030
11Bacillus megaterium116229
12Clostridium propionicum59914
13Stenotrophomonas maltophilia4080
14Bacteroides hypermegas2030
15Актиномицеты016129
16Pseudonocardia58816
17Streptomyces312524
18Clostridium ramosum413823
19Fusobacterium/Haemophylus0060
20Klebsiella 2h1434512
21Репер0000
22Flavobacterium40110
23Rhodococcus212323
24Баланс100180
25Porphyromonas70150
26Corineform(Listeria) а17210416
27Lactobacillus410714
28Campylobacter mucosalis120220
29Mycobacterium/Candida113323
30E.coli3131019
31Eubacterium moniliforme3060
32Cl.difficile112320
33Actinomadura013324
34Prevotella017129
35Eubacterium/Enterococcus113187
36Bacteroides fragilis100150
37Staphylococcus26711
38Bifidobacterium56610
39Helicobacter pylory, h180010
40Clostridium perfringens67916
41Enterococcus351010
42Eubacterium101213
43Eubacterium sp. A17a37711
44Streptococcus112220
45Herpes58916
46Микр грибы1061610
47Nocardia asteroides39716
48Цитомегаловирус016228
49Микр грибы93205
50Propionibacterium acnes150270
51Ruminicoccus761411
52Actinomycetes 10Me14016129
53E.lentum  7741, 14a115228
54Enterococcus faecalis5090
55Bacteroides ruminicola0000
56Eubacterium spp.210618
57Микр грибы0000

 

Изменение микрофлоры тонкой кишки у больных СРК с преобладанием диареи

Как видно из табл 4 при СРК наблюдаются такие же изменения, как и в случае ААД. Обследовано большее число пациентов, но значительная часть из группы ААД входит в группу больных с синдромом раздраженного кишечника. В связи с этим можно высказать предположение, что СРК с преобладанием поносов является одним из последствий интенсивного лечения антибиотиками. Все перечисленные микроорганизмы являются естественными обитателями кишечника, поэтому в пределах чувствительности метода (в данном случае 105 кл/г) фактически наблюдается изменение количественного состава микроорганизмов, колонизирующих в норме кишечник, что обычно называется дисбиозом.

Как показывают параллельные измерения концентрации микробных маркеров в крови у тех же пациентов, у которых исследовались биоптаты тонкого кишечника, тенденция изменения их концентрации совпадает. На рис. 3 сопоставлены данные измерений маркеров бактерий в биоптате тощей кишки и в крови у больного СРК. На анализ взяты: биоптат слизистой кишечника — 4 мг и кровь из пальца — 50 мг. Как правило, концентрация микробных маркеров меняется синхронно в крови и слизистой оболочке кишечника, что  позволяет предположить возможность оценки дисбиоза по составу молекулярных компонентов микроорганизмов в крови, что практически реализовано в рутинной диагностике. 
Рис 3. Сопоставление дисбиоза кишечника по микробным маркерам в крови и в биоптате тощей кишки (клеток/мл х106). Противофазные кишечнику изменения концентрации маркеров Cl. Ramosum, бифидобактерий, стрептококков и руминококков связаны с их доминирующим избыточным ростом в толстом кишечнике.
 
 

Выводы
  1. Полученная численность для фекалий находится в пределах интервала значений 1011— 1012 кл/г, известных из литературных данных. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными полученные сведения о составе микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки.
  2. Состав микробиоты существенно и специфически меняется при заболеваниях кишечника. Возможность его количественного и экспрессного мониторинга методом ГХ-МС (в том числе — по крови) дает возможность выбора адекватного лечения и контроля его эффективности.
  3. Следует обратить внимание на существенную долю эубактерий (род Eubacterium) среди других микроорганизмов кишечника (27% в тощей и 16% в ободочной кишках) и их специфическое видовое изменение при заболеваниях. Учитывая их физиолого-биохимическую активность, можно ожидать не меньшего, чем от регуляции численности бифидобактерий и лактобацилл эффекта на лечение кишечных патологий.
  4. Концентрация стрептомицетов, родококков и других представителей порядка Actinomycetales в десятки раз увеличивается и/или уменьшается при патологических состояниях. Представляется перспективной разработка и использование для нормализации микробиоза кишечника пробиотиков и пребиотиков на основе этой группы (а также других) бактерий.
  5. Увеличение в десятки раз концентрации маркеров лактобацилл и бифидобактерий при некоторых болезнях побуждает к дифференцированному применению широко распространенных пробиотиков на основе этих бактерий.

Добавить комментарий