Метод и прибор для экспресс определения антиоксидантного статуса пациента

А.Я.Яшин, Т.А.Михайлова, В.Н.Титов, В.С.Сускова, Н.И.Габриэлян, С.И.Сусков, М.Н.Козлова*, Я.И.Яшин

Ключевые слова: антиоксидантный статус, амперометрический метод, свободные радикалы, сыворотка, моча, слюна, желудочный сок, желчь.

Резюме. Обобщены аналитические и диагностические возможности проточно-инжекционной системы «Близар» для экспресс определения суммарной антиоксидантной емкости у практически здоровых людей и пациентов с разной патологией на основании определения содержания антиоксидантов — аналитов в сыворотке крови, слюне, моче, желудочном соке, желчи в разных медицинских учреждениях.

Определены величины суммарной антиоксидантной емкости (САЕ) биологических жидкостей у больных с желудочно-кишечными, сердечнососудистыми, онкологическими заболеваниями, а также у больных диабетом, у больных до и после пересадки сердца, почек и части печени. Проведено сопоставление величин САЕ у здоровых людей с разной группой крови. Величины САЕ были определены у более 900 больных и здоровых людей. Многие измерения выполнены впервые. Результаты этих измерений показывают, что амперометрический метод и прибор «Близар» на его основе может быть использован для экспрессного, скринингового определения состояния антиоксидантной системы человека, оценить тяжесть течения заболеваний и повысить эффективность профилактических и лечебно-реабилитационных мероприятий.
Введение. Исследованиями последних лет установлено, что окислительно – восстановительные реакции — неотъемлемая часть жизни клетки, во многом определяющая стабильность гомеостаза живого организма. В процессе жизнедеятельности клетки постоянно используют реакции ПОЛ (перекисного окисления липидов) для обновления мембран и поддержания их структуры. В физиологических условиях ПОЛ протекает на крайне низком уровне, что предохраняет организм от накопления токсических продуктов (липоперекисей, альдегидов, кетонов, оксикислот) в концентрациях, опасных для жизнедеятельности. Избыточная активация реакций свободнорадикального окисления встречается при самых различных заболеваниях и является начальным этапом развития окислительного стресса. Доказано участие свободных радикалов в патогенезе многих заболеваний (шок различного генеза, атеросклероз, нарушение мозгового, коронарного и периферического кровообращения, сахарный диабет и диабетическая ангиопатия, ревматоидные, воспалительные и дегенеративные, заболевания опорно – двигательного аппарата, поражение глаз, легочные заболевания, онкология, термические поражения, различные интоксикации) и преждевременном старении. Постоянство естественной антиоксидантной емкости служит одним из показателей сбалансированного гомеостаза и является важной частью адаптационного синдрома.
Окислительный стресс может развиться и у здоровых людей, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов: облучения (радиационные, рентгеновские, уф и др), стрессы, загрязнители пищевых продуктов и окружающей среды, курение, алкоголизм, наркомания, сильные физические перегрузки, перегревы и др.
Стойкое увеличение содержания в клетках свободных радикалов создает условия для, так называемого, оксидантного (окислительного) стресса; при этом свободные радикалы спонтанно окисляют клетки монослоя эндотелия стенки сосудов, молекулы белков, ДНК, липиды. Особенно активно радикалы взаимодействуют с липидами мембран, которые содержат ненасыщенные, двойные связи (-С=С-), изменяя при этом физико-химические свойства клеточных мембран. Самые активные свободные радикалы разрывают связи в молекуле ДНК, повреждают генетический аппарат клеток, регулирующий их рост. Это приводит к формированию онкологических заболеваний. Липопротеиды низкой плотности после окисления могут откладываться в интиме артерий эластического типа, что приводит к формированию атеросклероза и иных сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время более 200 болезней связывают с участием в патогенезе окислительного стресса. Окислительный стресс играет важную роль и в патогенезе старения. Поэтому исключительно важно диагностировать начало окислительного стресса, пока он не стал причиной серьезного заболевания. Окислительный стресс можно приостановить, используя антиоксидантные лекарства и антиоксидантную терапию [1-3].

В последнее время прием антиоксидантных препаратов стал широко популярен, но необходимо помнить, что в некоторых случаях антиоксиданты могут выступать в роли потенциальных про – окислителей и неконтролируемый прием антиоксидантных препаратов может привести к нежелательным последствиям и ухудшению состояния здоровья пациентов, равно как и недостаточное их поступление в организм человека. Поэтому, так важно перед назначением антиоксидантной терапии контролировать уровень антиоксидантной емкости биологических жидкостей, в частности, сыворотки крови. А так же, с профилактической целью проводить скрининговое исследование антиоксидантного статуса у так называемых, условно здоровых пациентов, без клинических проявлений заболеваний, для выявления отклонений от нормы в работе антиоксидантной системы организма.

В отечественной и зарубежной литературе можно встретить большое число различных методов определения антиоксидантов и их емкости. Однако, эти данные имеют разрозненный характер, используют разные модельные системы, представления о характере их действия на радикалы различной природы. Полученные данные имеют разные размерности, что не позволяет сопоставить их друг с другом. Достаточно мало аттестованных методик и сертифицированных приборов, способных быстро на качественно высоком уровне определить суммарную антиоксидантную активность. Поэтому обобщение информации и поиск новых возможностей определения антиоксидантов и их емкости является на сегодняшний день актуальной задачей.
Описаны следующие методы для определения антиоксидантной емкости биологических жидкостей [4-7]. Однако, все эти методы косвенные, между ними плохая корреляция [6, 7]. Амперометрический метод прямой, он непосредственно определяет только антиоксиданты [8,9].

Описание, принцип работы прибора. Амперометрический метод определения основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом.

Чувствительность амперометрического метода определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенным к нему. В качестве материала рабочего электрода используются: стеклоуглерод, золото, платина, серебро, медь, никель, палладий и др. Потенциал может устанавливаться в пределах от 0 до 2,5 В.
Известно, что амперометрический метод анализа обладает рядом преимуществ: низким пределом обнаружения, высокой селективностью (определяются только соединения, молекулы которых могут окисляться, другие соединения, присутствующие даже в больших концентрациях не определяются), малым объемом ячейки (0,1-5 мкл), простотой обслуживания.
В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные и тиольные группы, предел их обнаружения на уровне 10-9 – 10-12 г, в благоприятных условиях некоторые соединения определяются на уровне 10-15 г (фемтограммов).

Основные и наиболее активные природные антиоксиданты имеют фенольную природу. Это природные полифенолы, разные типы флавоноидов, фенольные оксикислоты, витамины и другие.
Прибор включает в себя: емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, амперометрический детектор, состоящий из термостатируемой электрохимической ячейки со сменными рабочими электродами, усилитель тока, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Прибор позволяет проводить прямые количественные измерения антиоксидантной емкости исследуемых проб, содержащих биологически активные соединения [9] (Рисунок 1).

Рисунок 1. Внешний вид прибора для определения суммарного содержания антиоксидантов

Результаты. В кратком обзоре обобщены данные, полученные в пяти медицинских учреждениях г. Москвы.

Антиоксидантная активность биологических жидкостей человека – это показатель, характеризующий активность защитных реакций организма в ответ на появление свободных радикалов. Значения антиоксидантной емкости могут меняться при патологии, отражая физическое и функциональное состояние органа или системы, продуцирующей эту жидкость либо при воздействии внешних неблагоприятных факторов. На приборе «Близар» (ранняя модификация «ЦветЯуза-01-АА») в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава «НКЦ геронтологии» было проведено исследование суммарной  антиоксидантной  емкости  (САЕ) сыворотки крови у 480 пациентов разного возраста и пола (от 18 до 102 лет).

Пациенты  были разделены на  8 групп по 50 человек в каждой возрастной группе. В исследование не включались пациенты, отказавшиеся принять в нем участие, имеющие лекарственную аллергию, принимающие антиоксидантную терапию. На момент обследования все сопутствующие заболевания находились в стадии стойкой клинической ремиссии. Группы были сформированы по десятилетиям, для оценки изменений суммарной антиоксидантной емкости происходящих за этот временной период. Среди всех обследованных пациентов преобладали женщины  — 288 человек (57%) , мужчины – 192 человека  (43%). Для каждой возрастной группы  были установлены средние значения суммарной антиоксидантной емкости.

Таблица 1

Значения среднего уровня САЕ в каждой возрастной группе 

Как видно из приведенных данных, минимальная САЕ отмечается у пациентов в возрастной группе от 18- 30 лет (0,04± 0,1), постепенно увеличиваясь с каждым десятилетием и достигая максимума в группе 51-60 лет (0,18± 0,4).Затем  резко снижается в возрастной группе  61-80 лет(0,08 – 0,09  ± 0,2) , затем снова возрастает, достигая максимума у долгожителей(0,17± 0,1). Повышение САЕ сыворотки крови  с возрастом отражает процесс нарастания полиморбидности, с каждым десятилетием увеличивается количество сопутствующих заболеваний. По статистике самый высокий уровень смертности и полиморбидности находится в промежутке между 60-70 годами, в этот же период достаточно высока приверженность пациентов пожилого возраста к медикаментозной терапии, что возможно ведет к снижению уровня и стабилизации САЕ. Неясным остается факт повышения антиоксидантной емкости у долгожителей. Является ли  это проявлением физиологического старения с адаптационным повышением САЕ или это проявления патологического старения. Среди препаратов принимаемых пациентами, много препаратов с антиоксидантной активностью, которые могут влиять на показатели САЕ. Гендерных различий САЕ отмечено не было. Показатели САЕ в одинаковых возрастных группах между мужчинами и женщинами не отличались.

На следующем этапе исследований  у пациентов всех вышеуказанных возрастных групп был одновременно произведен забор нескольких  видов биологических жидкостей. У каждого пациента одновременно было взята на анализ САЕ сыворотка крови, слюна, моча а так же, желудочный сок и желчь во время проведения гастроскопии. Из них 1 группу составили 36 пациентов в возрасте от 50 до 75 лет (средний возраст 62 года), 2 группу — 12 пациентов в возрасте от 18 до 40 лет (средний возраст 28 лет). Забор биологических жидкостей производился двукратно, с интервалом 4-5 часов. Статистическая обработка результатов проведена с помощью программы «Instat». Установлено, что САЕ сыворотки крови у пациентов из 1 группы была выше, чем у пациентов из 2 группы и составила 0,04-0,06 мг/мл и 0,01-0,03 мг/мл, соответственно (p<0,005). САЕ слюны у обследованных 1 группы была достоверно выше, чем у пациентов 2 группы (0,1 и 0,04 мг/ мл, соответственно). Показатели САЕ желчи и желудочного сока с возрастом не менялись и были практически одинаковыми в обеих группах (0,09 и 0,1мг/ мл, соответственно). Показатели САЕ мочи также не имели возрастных различий. САЕ крови, желудочного сока и желчи оставалась стабильной в течение 4-5 часов у пациентов разного возраста. САЕ слюны и мочи изменялась в течение непродолжительного времени (4-5 часов).

Таким образом, САЕ сыворотки крови отличается стабильностью, не меняя антиоксидантную активность в течение 4-5 часов, но увеличиваясь с возрастом, что можно расценивать как противовоспалительный компенсаторный механизм. САЕ желчи и желудочного сока не меняются с возрастом, их показатели стабильны. САЕ мочи, нестабильный, быстро меняющийся показатель, и ее нестабильность, возможно, связана с тем, что ее состав напрямую зависит от принимаемой пищи и метаболических процессов, происходящих в организме, не меняясь с возрастом. САЕ слюны снижается с возрастом, т.к. зависит от процессов, происходящих в ротовой полости, отражающих возрастную инволюцию слюнных желез.

Основные выводы этого исследования, показатели САЕ сыворотки крови, желудочного сока и желчи, отличающиеся стабильностью, могут быть использованы в клинической практике как скрининговый тест определения патологических состояний, сопровождающихся окислительным стрессом.

Далее были проведены исследования САЕ сыворотки крови у пациентов разных возрастных групп с заболеваниями сердечно сосудистой системы. Пациенты были разделены на 3 группы по тяжести течения заболевания. В первой группе – 38 пациентов с легким течением АГ (артериальной гипертонии), вторую группу составили 20 пациентов с ИБС и стабильной стенокардией, в третьей группе -27 пациентов с острым инфарктом миокарда (ОИМ). В четвертой группе — 20 человек здоровых добровольцев разного пола и возраста (контрольная группа). Показатели САЕ сыворотки крови этих пациентов были сравнены с одновременно взятыми показателями маркеров окислительного стресса (малоновым диальдегидом (МД), гомоцистеином (Гц), С- реактивным белком (СРБ) (ультра чувствительный метод) и мочевой кислотой. Данные этого исследования приведены в таблице №2.

Таблица 2

Показатели уровней маркеров окислительного стресса у пациентов с разными формами ИБС.

Полученные данные свидетельствуют о том, что САЕ сыворотки крови, показатели уровня малонового диальдегида, гомоцистеина, С-реактивного белка и мочевой кислоты повышаются при развитии сердечно – сосудистой патологии и нарастании тяжести сердечно – сосудистых заболеваний, что вероятно отражает степень гипоксии  и уровень окислительного стресса. У здоровых пациентов контрольной группы все показатели  находятся на уровне нормы, повышаясь у пациентов с артериальной гипертонией и ИБС и достигая максимального значения при остром инфаркте миокарда.

Из таблицы следует, что суммарная антиоксидантная активность сыворотки крови коррелируется по показателям с другими методами определения окислительного стресса  и может косвенно отражать остроту патологического процесса.

Были также проведены исследования САЕ сыворотки крови у пациентов старших возрастных групп, к стандартной терапии которых были добавлены витаминно –минеральные комплексы с антиоксидантной  активностью (первая группа — 20 пациентов разного пола  в возрасте от 50 – 70 лет). Вторую группу составили пациенты без добавления витаминно – минерального комплекса (20 пациентов разного пола  в возрасте от 50 – 70 лет). Сыворотка крови забиралась у пациентов дважды, до проведения исследования и после прохождения курса терапии через месяц приема препаратов. В результате проведенного исследования выявили, изначально низкий уровень САЕ после приема антиоксидантного комплекса повышался, приходя к нормальному, среднему уровню значения, У пациентов с высоким уровнем САЕ снижался, приходя к среднему значению. У пациентов с изначально нормальной САЕ на фоне приема антиоксидантного комплекса выявляли незначительное повышение САЕ с быстрым возвращением показателей к норме. Из чего следует, что прием препаратов с антиоксидантными свойствами нормализует уровень САЕ сыворотки крови и положительно влияет на работу антиоксидантной системы человека.

ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздравсоцразвития РФ. Было сопоставлено значение САЕ сыворотки крови у 10 здоровых доноров и 10 пациентов с инфарктом миокарда. Получены следующие значения: средние САЕ доноров – 0,52 мг/мл, среднее значение у пациентов с инфарктом миокарда 0,78 мг/мл. Хроматографическое исследование с амперометрическим детектированием, также подтвердило, что концентрации компонентов, определяющие антиоксидантную емкость больше у людей с инфарктом. У пожилых людей (68-70 лет) САЕ с гипертонической болезнью было 0,09-1,1, у людей с ишемией миокарда – стабильное состояние 0,58, состояние острое 0,77, после инсульта 0,76.

Определены значения САЕ сыворотки крови у больных гипертонической болезнью и здоровых людей (контроль). Среднее значение САЕ у больных ишемической болезнью 0,61+0,02/-0,02, у здоровых людей 0,46+0,01/-0,02.

ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И.Шумакова» Минздрава РФ. В этом центре проведены клинические исследования амперометрического метода измерения суммарного количества антиоксидантов в биологических жидкостях у пациентов после трансплантации жизненно важных органов и у кардиохирургических больных.

В процессе выполнения работы были обследованы 100 пациентов. Из них 32 – кадровых доноров крови отделения переливания крови, 54 – кардиохирургических и 14 трансплантационных пациентов.

Больные обследовались до и после операции как в раннем (до 3 суток) в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии, так и в позднем послеоперационном периоде (на 7-21 сутки) после перевода в специализированные отделения института.

В качестве основного объекта исследования использовали сыворотку, полученную из венозной крови. Подготовка проб сыворотки для подсчета в них антиоксидантов также была унифицирована.

Оптимальным режимом подготовки проб явилось использование в день забора и после первого размораживания.

Гендерных различий при определении САЕ не замечено.

Впервые определена САЕ сыворотки крови у лиц с различной группой крови (таблица 3). Наибольшее значение уровня САЕ оказалось у доноров с первой (0,13 мг/мл) и второй группой крови (0,12 мг/мл). У пациентов со второй группой крови отмечалось незначительное снижение среднего уровня САЕ по сравнению с первой группой. У доноров третьей (0,09 мг/мл) и четвертой группы (0,09 мг/мл) показатели были существенно ниже, чем в первой и второй группе, однако, между собой практически не отличались.

Таблица 3

Зависимость суммарной антиоксидантной емкости сыворотки крови от группы крови доноров.

Таблица 4

Определение САЕ амперометрическим методом у кардиохирургических больных.

До операции в группе кардиологических больных с ишемической болезнью сердца, приобретенными пороками сердца и сочетанной недостаточностью, нуждающихся в хирургической коррекции, уровень САЕ превышал референсные значения, выявленные у доноров. Также отмечалась индивидуальная вариабельность САЕ, требующая отдельного анализа с учетом выраженности окислительного стресса и клинического состояния.

В группе кардиохирургических больных с осложненным послеоперационным периодом отмечалось дальнейшее повышение уровня САЕ. Наиболее высокая САЕ отмечалась  у пациента с бактериальным эндокардитом (0,85 мг/мл) (таблица 4).

Выявлена динамика САЕ у кардиохирургических больных в процессе послеоперационного мониторинга, отражающего клиническое состояние больных и состояние САЕ.

При наличии рецидивирующей персистирующей внутриклеточной инфекции отмечается вариабельность САЕ, сопряженная с активацией инфекции, и требующая дальнейшего продолжения исследований.

Впервые измерены значения САЕ у пациентов после пересадки разных органов (сердце, почки, доли печени) (таблица 5)

Вариабельность показателей САЕ у пациентов с аллотрансплантацией почки и сердца имеет сопряженность с клиническим состоянием и осложненным течением. Небольшая выборка требует дальнейших исследований.

Таблица 5

Определение суммарной (САЕ) сыворотки крови амперометрическим методом у пациентов после аллотрансплантации жизненноважных органов.

Сопоставление суммарного содержания антиоксидантов в сыворотке крови и слюне пациентов разного возраста проведено в таблице 6. Значения САЕ в слюне было в 2 – 2,5 раза выше, чем в сыворотке крови. У пациентов с сахарным диабетом и у пациентов с различной возрастной патологией суммарное содержание антиоксидантов выше, чем у здоровых людей (таблица 7). Проведенные клинические исследования по определению САЕ у кардиохирургических и трансплантационных больных, здоровых лиц – доноров,  подтвердили возможность применения амперометрического метода и прибора «Близар» в качестве нового высокотехнологического и экспрессного метода определения САЕ у разных категорий пациентов, для контроля за состоянием и течением заболевания, а так же, с профилактической целью у здоровых.

Таблица 6

Результаты исследования суммарной антиоксидантной емкости  (САЕ)  сыворотки крови и слюны пациентов разного возраста

Таблица 7

Результаты исследования суммарной антиоксидантной емкости (САЕ) в сыворотке крови и слюне у пациентов с сахарным диабетом 2 типа и у больных с воспалительными заболеваниями

Исследования в Московском онкологическом институте им.Герцена. У 100 пациентов был определен антиоксидантный статус на приборе «Близар». Из них 70 пациентов с различными видами онкологии и 30 здоровых добровольцев контрольной группы. У пациентов с онкологией уровень  САЕ сыворотки крови на 30% был ниже, чем у здоровых добровольцев. (данные Т.П.Хованской и А.В.Паринова)

Московский наркологический центр

Было обследовано 205 человек. Определено суммарное содержание САЕ мочи у юношей 17-18 лет (студенты первого курса технического университета им. Баумана). У 135 человек среднее значение САЕ было 0,28 мг/мл (относительно кверцетина), у 36 человек – 0,51 мг/мл и у 34 человек – 0,1 мг/мл. Исследования были анонимными, т.к. одновременно определялось наличие наркотических веществ в моче. Явной связи с наличием наркотических препаратов в моче и САЕ не выявлено. Повышение САЕ в моче могло быть связано с употреблением накануне пищи или напитков, богатых антиоксидантами а так же, свидетельствовать  о воспалительном процессе в мочевыводящих путях.

Можно только предположить, что больше половины (65%) студентов были здоровыми, а у 35% имелись отклонения, причем примерно 17% в меньшую и большую сторону (данные Ю.Ю.Дубасовой и А.Г.Ильиной).

Заключение. Приведены результаты по определению суммарной антиоксидантной емкости различных биологических жидкостей у пациентов разного возраста и пола, с острой и хронической патологией в состоянии обострения и ремиссии, а также у здоровых добровольцев с профилактической целью в 5 медицинских учреждениях г.Москвы (всего более 900 больных и здоровых). Большинство результатов показывают, что предложенный метод и прибор может быть использован как экспрессный, скрининговый тест состояния антиоксидантной системы человека, позволяющий оценить тяжесть течения заболевания и повысить эффективность профилактических и лечебно – реабилитационных мероприятий.

Литература

1. Matkovics A. New strategies of antioxidant therapy // Orv. Hetil. 2006.v.147. p.747-752.
2. Шанин Ю.Н., Шанин В.Ю., Зиновьев Е. В. // Антиоксидантная терапия в клинической практике. Изд-во. «Элби».Москва. 2009. 128с.
3. Nemser B.V., Yashin Ya.I., Yashin A.Ya. The Issues of Antioxidant Therapy // American Journal of Biomedical Sciences. 2013.v.5.p.80-108.
4. Psotova J., Zahalcova J., Hrbac J. et al. Determination of total antioxidant capacity in plasma by cyclic voltammetry. Two case reports // Biomed. Papers. 2001.v.145.p.81-83.
5. Ghiselli A., Serafini M., Natella F., Scaccini C. Total antioxidant capacity as a tool to asses redox status: critical view and experimental data // Free Rad.Biol.Med. 2000.v.29.p.1106-1114.
6. Prior R.L., Gao G. In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods // Free Rad.Biol.Med 1999.V27.p.1173-1181.
7. Rise-Evans C., Miller N.J. Total antioxidant status in plasma and body fluids // Methods in Enzymology. 1994.v.234.p279-293.
8. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Артемьева О.В., Рогачева Н.А., Серова Л.Д. Амперометрический метод определения антиокислительного статуса у пациентов разных возрастных групп // Альманах «Геронтология и гериатрия». Москва.вып.5,2006, с.151-155.
9. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных соединений. Патент №2238555. Приоритет 25.07.2003г.