Возможности масс-спектрометрии микробных маркеров в лабораторном мониторинге дисбиозов и инфекций

Метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) использует детектирование микроорганизмов по видоспецифичным высшим жирным кислотам (ЖК) фосфолипидов и липополисахаридов их клеточной стенки. Он сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 16s-рРНК и пр.), поскольку состав жирных кислот закодирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего  синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Известно, что хемодифференциация микроорганизмов по клеточным ЖК коррелирует с их генетической классификацией.  Для реализации метода используется хромато-масс-спектрометрия с мультиионным селективным детектированием структурных ЖК – маркеров микроорганизмов. Метод около пятнадцати лет проходил апробацию медицинских учреждениях  г. Москвы. В 2010 году Росздравнадзором разрешено его применение в качестве новой медицинской технологии «Оценки микроэкологического статуса  человека методом хромато-масс-спектрометрии» на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).
За последние два десятилетия по различным программам федерального уровня многие лечебно-профилактические учреждения, медицинские центры и университеты России оснащены системами газовый хроматограф — масс-спектрометр (ГХ-МС) приборами типа АТ 5850/5973 фирмы Agilent Technologies (США), аналогичных приборах фирм Shimadzu (Япония) и Thermo (Finnigan). Они могут носить название «Газовый хроматограф с масс-селективным детектором (МСД)». Для реализации метода принципиально необходимо, чтобы ГХ-МС система обеспечивала работу в режиме селективных ионов (синонимы: масс-фрагментография, Single Ion Monitoring) и отвечала требованиям формирования стандартных масс-спектров и линейности концентрации маркеров в динамическом диапазоне четырех порядков. Разработанный в России метод МСММ (Осипов, 2000) дает возможности реализации этого оборудования у каждого владельца для рутинного клинического бактериологического анализа и мониторинга в реальном времени наряду и в дополнение к другим микробиологическим анализаторам, но с преимуществами по ряду принципиально важных параметров диагностики.
Рис.1. Типичная конфигурация ГХ-МС системы, включающая газовый хроматограф с масс-селективным детектором (слева) и компьютер с принтером (справа).
 
Существующая методология микробиологического обследования пациента в клинических лабораториях по разным причинам сводится к анализу всего лишь десятка родов аэробных микроорганизмов из числа энтеробактерий, аэробных кокков и псевдомонад. Невольно игнорируется большинство клинически значимых микробов из числа аэробных актинобактерий, всех анаэробов и других трудно культивируемых микроорганизмов. Это считается нецелесообразным из-за существенного увеличения стоимости анализа и времени ожидания результата, которое становится сопоставимым со временем пребывания больного в стационаре. Число неучтенных при обследовании каждого больного составляет сотни видов, так как давно известно, что в организме человека и в окружающей среде присутствует около пятисот видов, способных вызвать инфекционных процесс или воспаление. Если они известны, и их клиническая значимость описана, значит, они выращены и регулярно культивируемы в искусственных условиях. Об этом свидетельствуют материалы солидных руководств по клинической микробиологии, публикации в периодической научной печати и диссертации разного уровня, защищенные в России и за рубежом. Пользуясь информационной мощью сети Интернет нетрудно показать, что каждый микроб является потенциально патогенным. Лактобациллы и бифидобактерии, причисляемые к абсолютно полезным микробам оказываются агентами многих воспалительных процессов, в том числе септических состояний и эндокардита. Кроме того на сегодня не вызывает сомнений, что инфекции и воспаления не являются моноэтиологичными (кроме абсолютных патогенов и особо опасных инфекций), рано или поздно выясняется участие в них группы микроорганизмов, объединенных в генетически и трофически организованные сообщества, называемые биопленками. Сам организм человека оказывается основным источником микробов, и в первую очередь анаэробов. Анаэробы — доминанты микробиоты человека. Их места обитания – плотные мукопептиды слизистых оболочек кишечника, дыхательных путей, урогенитального тракта и закрытых от прямого доступа кислорода компартментов кожи. Аэробы не характерны для таких мест обитания микроорганизмов. Приходится признать, по современным научным представлениям о микроэкологии человека, что аэробы вторичны в количественном (и функциональном плане тоже) в нормальной и патофизиологии его органов. Отсюда следует, что источники инфекции (кроме особо опасных и облигатных возбудителей инфекций) сосредоточены преимущественно внутри человека, а не в окружающей среде и что доля анаэробов существенно превалирует над аэробами и это пора учесть в практике рутинных анализов лабораторий клинической микробиологии. Аэробы, являющиеся основным объектом работы клинических лабораторий, представляются лишь как биологические маркеры основной инфекции, вызванной анаэробами. Кроме того, практика посева на питательные среды из мочи, крови, ликвора показывает нерегулярность выявления патогенна даже при септическом состоянии пациента, так как сами эти биологические жидкости по определению стерильны, содержат компоненты иммунной системы макроорганизма, то есть препятствуют выживанию микробов. Вероятность высева микробов из мазков тампонами со слизистых также мало эффективна, так как по существу организации микробной биопленки в них может содержаться лишь выведенный с разложенным мукозом на поверхность микробный дебрис или нежизнеспособные клетки.
Приведенные выше соображения объясняют малую информативность практики клинических бактериологических исследований. Выход из сложившейся ситуации виден либо в расширении и углублении процедуры обследований культурально-биохимическим методом с обязательным включением в постоянную практику анаэробов и актинобактерий с усовершенствованием техники отбора проб, либо внедрение новых технологий микробиологического анализа, лишенных недостатков, связанных с необходимостью получения биомассы живых микроорганизмов в искусственных условиях.
В этом отношении перспективен метод МСММ, в основе которого лежит высокоточное определение в анализируемой пробе молекулярных маркеров микроорганизмов – высших жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеролов, входящих в состав их клеточной стенки. Определение производится высокочувствительным и селективным методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС), позволяющим одновременно измерять более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале, крови, моче, биоптатах, пунктатах, мокроте, и других биологических жидкостях и тканях без предварительного посева на питательные среды или использования тестовых биохимических материалов. Для максимального исключения ручных операций разработан автоматический алгоритм анализа с помощью штатных программ ГХ-МС и собственной программы реконструкции микроэкологического статуса пациента, дисбактериоза и полимикробной инфекции по данным концентраций микробных маркеров, вычисляемых относительно внутреннего стандарта с изотопной меткой. Технология  позволяет определять концентрацию более 50 микроорганизмов в клиническом материале через три часа после его поступления в лабораторию. Метод подтвержден патентами на изобретения, его научная обоснованность заключена в четырнадцати кандидатских и докторских диссертациях и десятках публикаций в научной периодике, в том числе в иностранных реферируемых журналах, а также в методических пособиях и монографиях (Бондаренко, 2003; Осипов, 2010).
В последнее время метод внедрен в клиническую и экологическую лабораторную диагностику в Санкт-Петербурге, Красноярске, Улан-Удэ, Перьми и Краснодаре.
По сравнению с традиционными методами бактериологического исследования использование метода МСММ позволяет значительно сократить время и стоимость исследования, минуя стадии  культивирования микроорганизмов и тестовых ферментаций, которые особенно сложны и трудоемки для анаэробов. Метод позволяет определять маркерные вещества микроорганизмов экспрессно, за 2,5 часа в прямом анализе клинического материала, выявлять и количественно определять состав полимикробной инфекции или изменение микроэкологического статуса организма человека.  Он легко поддается стандартизации, для его реализации используются доступные любым лабораториям химические реактивы: гексан, метанол, соляная кислота, немного дейтерометанола и единственный импортный реактив – силилирующий агент для хроматографии N,O-бис-(триметилсилил)-трифторфцетамид стоимостью $35 на 200 анализов (Рис. 2).  Дополнительные инструменты: термоблок, микропипетки. Отсюда видно экономическое преимущество метода: после приобретения прибора нет необходимости покупать дорогостоящие стандартные наборы реактивов, сред, картриджей, праймеров и других расходуемых материалов, стоимость которых в расчете на год близка к стоимости самого анализатора.

Рис. 2. Весь набор инструментов и реактивов для подготовки клинического материала к количественному анализу микробных маркеров.
 
Подготовка пробы к хромато-масс-спектрометрическому анализу.
 
Кровь, ликвор, слюна, смыв, мазок, дренаж, экссудат. Для анализа цельную кровь в количестве 40мкл пипеткой переносят в виал, емкостью 1,5 мл, с завинчивающейся крышкой, имеющей тефлонированную прокладку, подсушивают (при снятой крышке) в термостате при 80⁰С  с добавлением 40мкл метанола для ускорения сушки. Ликвор или слюну для анализа берут в количестве 80 мкл и подсушивают с добавлением 80 мкл метанола. Для других материалов возможны варианты в зависимости от его количества и вида. К загустевшей пробе приливают 400 мкл 1М соляной кислоты в метаноле, завинчивают плотно крышкой и подвергают кислому метанолизу при  80⁰С в течение 1 часа. К охлажденной реакционной среде добавляют 300 нг стандарта (дейтерометиловый эфир тридекановой кислоты) в виде заранее приготовленного раствора в гексане. Затем проводят экстракцию порцией 400 мкл гексана при кратковременном встряхивании на вибраторе типа Vortex и выстаивании в течение 5 мин при комнатной температуре. Экстракт переносят в чистый виал, высушивают 5-7 мин при  80°С и обрабатывают 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида, в течение 15 мин при 80°С при закрытой крышке. К реакционной смеси добавляют 80 мкл гексана. В таком виде проба пригодна для анализа в течение недели, если она герметично закрыта и не происходит ее испарения.
Для проведения анализа смесь эфиров в количестве 2 мкл вводят в инжектор ГХ-МС системы Анализ проводят методом мультиионнной масс-фрагментографии, контролируя в определенной последовательности по автоматической программе  характерные ионы из масс-спектров жирных кислот, специфических для микроорганизмов.
Метод МСММ благодаря своей экспрессности и информативности позволил в течение короткого времени внести ясность в ряд концептуальных проблем клинической микробиологии и микробной этиологии серьезных заболеваний. Получены экспериментальные данные, подтверждающие связь ряда заболеваний с изменением микроэкологического статуса организма (Клиническое значение, 2011). Иначе говоря, нозологическую специфичность этого изменения. Возможность предметного обсуждения этого, предполагаемого ранее явления, обусловлена получением в короткие сроки точной и воспроизводимой, а значит – сопоставимой, информации о микробиоте человека в норме и патологии, а также и среди разных патологий инфекционной природы.
Микробиота человека (в основном – кишечника) содержит дополнительные геномы, состоящие из миллионов микробных генов – микробиом. Поскольку этот сложный симбиоз с микроорганизмами влияет на метаболизм, физиологию и экспрессию генов хозяина, возникло предположение, что человека надо рассматривать с общебиологических позиций как сложный биологический суперорганизм, в котором единое целое составляют как собственные клетки хозяина, так и населяющие его микроорганизмы (Kinross, 2008). Автор ссылается на серию работ с участием Nicholson JK, руководителя хорошо оснащенной биохимической лаборатории в Имперском колледже (Лондон, Англия), ядро которой составляют суперсовременные комбинированные приборы на основе ПЦР в реальном времени, различных вариантов масс-спектрометрии и ядерного магнитного резонанса. Аналогичное оборудование имеется в ряде американских и европейских стран, Японии, а также развивающихся стран, таких как Китай, Индия, Шри-Ланка. Под эгидой Nicholson J.K. эти центры опубликовали около тысячи научных работ за последнее десятилетие. Концепция Nicholson J.K. состоит в том что состав микробиоты кишечника здоровых людей зависит от генотипа хозяина, диеты, возраста и пола и подвержена влиянию лекарственных препаратов (в особенности антибиотиков). Наблюдаемый метаболический фенотип человека в свою очередь сильно зависит от кишечного микробиома (Nicholson, 2005). Метаболические продукты хозяина и микробиоты неразрывно связаны, пересекаются и подвержены диэтическим вариациям. Для изучения этих взаимодействий и переплетений метаболизма необходимо понять какие из человеческих метаболических путей наиболее тесно связаны со структурными вариациями кишечной микробиоты. Состояние суперорганизма отражается в сумме метаболитов микробов и хозяина, которые выявляют по данным анализа крови и мочи. Для контроля состояния здоровья человека необходимо разобраться в происхождении, определить источник этих метаболитов в сложной экосистеме (Goodacre, 2006). Так возникла метаболомика, как метод функционального анализа, целью которого является надежной и воспроизводимой количественной информации о внутриклеточных и внеклеточных метаболитах. Она приобретает повышенный интерес в широком перечне дисциплин, включая функциональную геномику, интегральную и системную биологию, нутриционную геномику, фармакогеномику, а также поиск биомаркеров для прогноза заболеваний, их диагностики и терапевтического мониторинга (Goodacre, 2006).  На сегодня эти работы остаются предметом поиска научных лабораторий, но не рутинной клинической лабораторной практики.  Отечественные работы последнего десятилетия показали возможность использования  ГХ-МС микробных маркеров и метаболитов (метаболомики и микро-метаболомики в современной терминологии) в качестве новой медицинской технологии для рутинного клинического анализа (Osipov, 2011). То есть технология исследований есть, остается только «разобраться в происхождении, определить источник этих метаболитов в сложной экосистеме» — о чем пишут Nicholson и Goodacre.
Фундаментальным результатом клинических приложений метода МСММ является подтверждение количества микроорганизмов в теле человека, в основном – в его кишечнике: порядка 10¹⁴ клеток, что было известно из оценок другими методами. Кроме этого, удалось измерить состав микробиоты непосредственно на кишечной стенке тощей, подвздошной и толстой кишки и показать ее гомеостатичность, что до сих пор только предполагалось из исследований и обобщений ряда ученых, работающих в области медицинской микробной экологии. Связующим звеном МСММ с культуральными и генетическими  методами послужил сопоставительный анализ фекалий. Он показал соответствие измерений. Метод МСММ оказался инструментом, с помощью которого можно проводить более точные количественные измерения, особенно в сопоставительных измерениях и клиническом мониторинге в реальном времени. Это позволяет проверять и подтверждать или уточнять постулаты и предположения микроэкологии человека и окружающей среды, в том числе изучать механизм взаимодействия микробиоты с организмом-хозяином. Например, внести ясность в вопрос связи дисбактериоза с заболеваниями, которым он сопутствует.
Рассмотрим по-отдельности что меняется в наших представлениях об инфекции, дисбактериозах, септических и гнойно-воспалительных процессах и системных микробиозах в связи с данными, получаемыми методом масс-спектрометрии микробных маркеров.
Клиническая процедура при использовании МСММ претерпевает существенные изменения, связанные с увеличением объема микробиологической информации по каждой пробе больного, сокращением времени анализа до трех часов, вместо недель и появлением в результатах непривычных для микробиолога и врача групп редко культивируемых микроорганизмов – большинства анаэробов, актинобактерий и других. Это требует принципиально новых подходов в лечении больных на основании измененных представлений о микробной экологии человека в норме и патологии. Врач должен учиться постоянно (Л.Рошаль).
В период накопления нового клинического опыта, необходимого для разработки оперативных алгоритмов решения и их формализации в виде протокольных разрешительных документов (методик, пособий, медицинской технологии) клиническая процедура выглядит следующим образом:
 

• Определение биологических проб, подлежащих анализу в соответствии с диагнозом или симптомами заболевания, если диагноз отсутствует
• Проведение анализа по полному алгоритму МСММ
• Составление заключения молекулярного микробиолога (врача-интерпретатора) по особенностям результатов анализа
• Поиск информации в собственной базе данных или Интернет по специфике заболевания и связанных с ним микроорганизмов с измененной концентрацией и оценка их причастности к конкретной патологии
• Выбор антибиотика по имеющейся базе данных или поиск в Интернет, если необходимо подавление избыточного роста численности микроорганизма при воспалениях, сепсисе, инфекциях ткани и избыточном росте микробиоты кишечника или УГТ и прочего
• Выбор стимуляторов роста микробов, если их дефицит угрожает нарушением физиологического гомеостаза макроорганизма
• Определение других мер для восстановления гомеостатической нормы органа или микроэкологического статуса организма больного в целом, включающих имуностимуляторы, пробиотики, пребиотики, энтеросорбенты, микроэлементы и т.п., а также диэтические и процедурные назначения, нормализующие деятельность кишечника и других органов, содержащих слизистые оболочки или иные компартменты обитания симбиотной микробиоты
• Контроль за реакцией больного на принятую терапию – мониторинг и коррекция лечения

 
Представление об инфекции. По устаревшему определению – инфекция есть размножение чужеродных организмов в теле организма-хозяина (Поздеев, 2001). Размножение нормальной микробиоты не рассматривается как инфекция. Измерения методом МСММ позволяет уточнить круг микроорганизмов, обитающих в теле человека и не относить их к инфекции, если их численность не превышает норы. В таком случае, распространенные среди врачей и пациентов выражения о стафилококковой, стрептококковой и многих других «инфекциях» выглядят терминологически некорректными, так как маркеры этих микроорганизмов обнаруживаются в норме на коже, в моче, в крови, в мазках и биоптатах слизистых оболочек разных органов. Маркеры дрожжей кандида также присутствуют в норме повсеместно. По существу ничего не меняется в представлениях об инфекции. Только терминологическая аккуратность как результат медицинского образования и образованности, а также медицинского просвещения населения. Кроме того, в приведенном выше определении отсутствует количественный фактор, который становится необходимым при использовании боле точного определения инфекции как избыточного роста микроорганизмов (Шендеров, 1998). Будет ли она патологически (клинически) значимой – зависит от количественной стороны процесса инфицирования органа. Для этого необходимо, чтобы возникла биопленка, прикрепленная к поверхности, чтобы число микробных клеток в ней превышало величину 10³ для возникновения quorum sensing – обобщения генетической, трофической, энергетической и прочей коллективной активности микробного сообщества. В том числе токсической и патогенетической, если будут экспрессированы  соответствующие гены. По выработанному ранее статистическому критерию (Белобородова, 1999)  отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой.
Представления о патогенезе.  Они тоже не меняются, если дополнять их новыми сведениями о расширении состава возбудителей, которые можно найти в научной литературе. К сожалению, они доходят до практического врача с большим запозданием. Поэтому, первое знакомство с результатами масс-спектрометрии выглядят неожиданными для тех, кто привык делить микроорганизмы на патогенные и непатогенные. На самом деле это деление можно характеризовать как условное. Данные масс-спектрометрии показывают, что патогенны (т.е. по определению – способны вызывать заболевание) все микроорганизмы. Пользуясь возможностями сети интернет,  можно легко убедится, что это действительно так, что лактобациллы и бифидобактерии – патогенны, и порой опасны для жизни, если являются причиной септического состояния. Это принципиально важное для пациента расширение понятия патогенности, которое теоретически дает  ему надежду на гарантированное излечение, если микробиологи возьмут под контроль не только десяток аэробных микроорганизмов, позволяющих себя легко культивировать в искусственных условиях, но и все анаэробы и актинобактерии. Сейчас хорошо известно, что организм человека населяют более 500 видов микробов (менее известно, что генетики уже выделили более 1000 фенотипов микробных ДНК). Получается, что в клинике контролируют рутинно только около 1% потенциальных патогенов. Поэтому лечение заболеваний микробной этиологии происходит по-существу эмпирически. Анализ запаздывает на неделю, то есть время, необходимое для выявления вида микроорганизма культурально — биохимическим методом. И при этом вероятность выявления истинного возбудителя ничтожно мала. Это подтверждается клинической апробацией метода МСММ. Стафилококки, псевдомонады, представители семейства энтеробактерий (кишечная палочка, протей, клебсиела и прочие) редко выступают в роли доминант микробной ассоциации при воспалениях. Как правило ими являются анаэробы родов Clostridium, Eubacterium, Propionibacterium, анаэробные и аэробные стрептококки, группа бактероидов (Bacteroides, Prevotella, Porfiromonas) и актинобактерии родов Streptomyces, Nocardia, Actinomyces, Rhodococcus, Nocardiopsis (Федосова, 2010). И это логично, поскольку, даже по известным оценкам, без масс-спектрометрических уточнений, в организме человека доминируют анаэробы (от 80 до 95% по разным данным). Значит, на долю аэробов приходится максимум 20%. Из них 17 % надо отнести к аэробным актиномицетам (актинобактериям). Отсюда следует, что аэробы, преимущественно контролируемые в настоящее время в клинических бактериологических лабораториях, — стафилококки, энтеробактерии сем Enterobacteriaceae, неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы родов Pseudomonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter и другие составляют около 3% возможных агентов воспалений.
Вновь выявляемые микроорганизмы (анаэробы, актинобактерии) формально подпадают под определение внутрибольничных (госпитальных, нозокомиальных) инфекций (ВИ), поскольку таковыми являются любые клинически выраженные  заболевания микробного происхождения, поражающие больного в результате его госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществления им деятельности. Нигде не оговорен списочный состав микроорганизмов, агентов ВИ, кроме того, что ими могут быть бактерии, грибы и вирусы. Но в клинической практике молчаливо подразумевается, что ими являются аэробные кокки, неферментирующие грамотрицательные бактерии, представители сем. Enterobacteriaceae, рода Candida, и другие, удобные для культивирования в условиях клинической бактериологической лаборатории микроорганизмы. Однако есть основания считать, что основным механизмом эндогенного инфицирования в стационаре является транслокация микроорганизмов кишечника при стрессовых воздействиях. А ими являются в основном анаэробы, не контролируемые в клинике. По данным МСММ при раневой инфекции и сепсисе происходит избыточный рост ряда микроорганизмов из состава нормальной микробиоты хозяина, что по определению является инфекцией. Наиболее часто доминируют лактобациллы и клостридии группы Clostridium ramosum c периодическим подключением представителей рода  Eubacterium. Более чем вдвое по сравнению с нормой растет концентрация маркеров актинобактерий Streptomyces и Nocardia. Общим признаком является аналогичное превышение концентраций маркеров видов Staphylococcus, Enterococcus, Candida и вирусов герпеса. Частично участвуют в инфекционном процессе грамотрицательные микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, Klebsiella и другие). Реже уровень клинической значимости (10⁵ клеток/мл) превышали маркеры Pseudomonas, Moraxella, Fusobacterium/Haemophylus, Selenomonas, Helicobacter pylori и Prevotella. Другие грамотрицательные бактерии, такие как представители родов  Stenotrophomonas, Acinetobacter, Neisseria, Bacteroides, Burkholderia, Francisella не превышали уровня клинической значимости (рис. 3) (Осипов, 2007). Данные по маркерам в некоторых случаях подтверждаются выявлением целого профиля жирных кислот и альдегидов в крови или моче и выявлением доминирующего микроба по базе данных чистых культур. Например, выявление актинобактерий рода Streptomyces при перикардите и мониторинге лечения больного, или клостридий группы C. ramosum при пиелонефрите.

Рис. 3. Состав полимикробной инфекции в области хирургического вмешательства, определяемый методом МСММ
 
В стерильной среде – моче, крови, ликворе, гное, экссудате и других жидкостях, которые имеют развитую антигенную систему, не должно быть жизнеспособных микроорганизмов. А вот молекулярные микробные маркеры присутствовать должны. В процессе естественного отмирания микробных клеток или фагоцитоза они попадают закономерным физиологическисм путем в эти жидкости. По ним можно реконструировать с помощью расчетного механизма метода МСММ микробную ассоциацию, которая реально действует в виде биопленки в тканях и в мукозном слое слизистых оболочек. Например, в ожоговом экссудате (рис 4).

Рис.4. Состав полимикробной инфекции кожи при ожоговом сепсисе. Реконструировано по микробным маркерам в ожоговом экссудате.
 
Чувствительность к антибиотикам
Для большинства врачей препятствием к использованию данных МСММ является отсутствие привычных данных по антибиотикочувствительности конкретного штамма микроба, выделенного из клинического материала пациента. Принимают данные и получают эффект в лечении больного те врачи, которые имеют возможность творчески подойти к их использованию: расширить свои познания в микробиологии и обратиться в интернет в поиске клинических проявлений микроорганизмов и их восприимчивости к антибиотикам, а также опыта врачей, уже имевших аналогичный клинический случай. Нами подготовлены краткие сведения по способам регулирования микроэкологического статуса при инфекции и дисбиозах (Клиническое значение, 2011), которые содержат информацию из литературных источников и опыта врачей, использующих метод масс-спектрометрии микробных маркеров. Эти сведения, полностью или частично, в соответствии с выявленными агентами инфекции или дисбиоза, мы предоставляем лечащему врачу вместе с результатами анализа.
Таким образом, по первичному анализу назначение антибиотиков производится по справочным и оригинальным литературным данным в отношении микроорганизмов, проявляющих избыточный рост – увеличение численности более чем вдвое по сравнению с нормой. Спустя сутки после достижения терапевтической концентрации антибиотика производится повторный ГХ-МС анализ, на основании которого определяется эффективность первичного назначения и проводится его коррекция с учетом микроорганизмов, не изменившим численность, а тем более обнаруживающих ее наращивание или конкурентный рост, как оппортунистическая микробиота. Экспрессность метода МСММ позволяет мониторировать лечение.

Рис 5. Мониторинг инфекции кожи по микробным маркерам в ожоговом экссудате в процессе лечения.
 
Из общих соображений, можно считать такой подход более рациональным по сравнению с тестированием резистентности клинического штамма in vitro, поскольку он, во-первых,  редко является истинным или единственным агентом воспаления, а во-вторых – чувствительность in vivo, как известно, далека от чувствительности в чашке Петри. Точнее – микробное сообщество в состоянии биопленки при quorum-sensing игнорирует любые самые сильные антибиотики. По нашим данным пристеночная микробиота кишечника крыс устойчива к ударным дозам антибиотика при длительном введении (Дьяченко, 2006). Опытные врачи это понимают и в качестве препаратов выбора при гнойно хирургических инфекциях, например, предлагают назначать аугментин, метронидазол и амикацин, хотя эта рекомендация логически мало связана с практикой преимущественного высевания стафилококка, клебсиелы или псевдомонад из клинического материала. Тем не менее, эти препараты оказываются эффективными. Метод МСММ объясняет, почему. Оказывается, что наиболее частыми агентами гнойных инфекций являются клостридии, эубактерии, другие анаэробы, а также актинобактерии, которые чувствительны к указанным препаратам. Кажущееся противоречие с устойчивостью бактерий в биопленке к антибиотикам и их восприимчивостью при этиотропном выборе разрешается предположением, что антибиотик прерывает распространение инфекции, воздействуя на планктонные микроорганизмы. Переводит состояние биопленки в фазу превалирования процесса гибели клеток над процессом размножения. В этом можно видеть объяснение известного суждения о важности ранней диагностики инфекции и  эффективности лечения заболевания на начальной стадии.
 
Применение пробиотиков и других корректоров микробиоты кишечника
В практике терапии в ЦНИИГ было установлено (Парфенов, 2006; Осипов, 2003) что одного пробиотика в сухом виде при концентрации 10⁷-10⁸ клеток в дозе даже бинарного и при десятикратной дозе не достаточно для быстрой стимуляции роста всех бактерий, находящихся в дефиците (тем более не входящих в состав пробиотика). Более перспективным выглядит применение жидких пробиотиков типа нормофлоринов, биовестинов или трилакта. В них на два порядка больше живых бактерий (N=10¹⁰)  и культуральная среда в качестве пребиотика. Конечно, и этого мало, чтобы восполнить недостаток или подрастить дефицитные лактобациллы или бифидобактерии – дело не в этом. Поскольку в кишечнике их порядка 10¹⁴ , то добавка пробиотика не восполняет дефицита по количеству клеток, но на самом деле клинический эффект достигается. Можно предположить, что живые культуры бифидо- и лактобактерий вместе с частью культуральной среды содержат биокаталитические вещества, стимулирующие восстановление не только этих, но и других микробов – то есть восстановление кишечного гомеостаза.
Нормализующее действие на нарушенную микробиоту кишечника оказывает синтетический тетрадекапептид гепон. В отличие от большинства известных иммуномодуляторов гепон обладает противовоспалительными свойствами, противовирусной активностью, способностью к активации местного иммунитета, повышению устойчивости слизистой оболочки к инфекциям. Уровень колонизации микроорганизмами тощей кишки возрастает до пяти  раз в сравнении с исходным уровнем, что актуально для больных СРК, у которых дефицит микробиоты может быть семикратным по сумме микроорганизмов. Базовые кишечные микроорганизмы — эубактерии, бифидобактерии и клостридии достигают или превышают уровень нормы. Лактобациллы остаются ниже нормы, хотя их численность увеличивается на порядок по сравнению с первоначальной. По многим микробам — кокки, актиномицеты, энтеробактерии, грибы обнаруживается восстановление нормы или избыточный рост более чем на порядок (Парфенов, 2003).
Препарат висмута ДеНол (висмута трикалия дицитрат), как оказалось, обладает воспроизводимым эффектом оптимизации  общего уровня колонизации тощей кишки и концентрации отдельных микроорганизмов (Осипов, http://www.rmj.ru/articles_5556.htm). То есть нивелирование дисбактериоза в сторону нормы: уменьшение концентрации микробов, проявляющих избыточный рост, и увеличение численности дефицитных микробов. Так реагируют на ДеНол основные обитатели кишечника – бифидобактерии, эубактерии а также пропионовые бактерии. К сожалению, исходный нормальный уровень лактобацилл в большинстве случаев понижается под действием препарата. Концентрации C. propionicum и C. hystoliticum при исходном низком уровне (на один-два порядка ниже нормы) после лечения увеличивают численность и достигают в ряде случаев нормального уровня. Численность C. difficile, как правило, уменьшается после лечения от 20% до шести раз. Численность актинобактерий (Actinomyces, Streptomyces, Nocardia), грибов и цитомегаловируса также имеет тенденцию к снижению. Заметно уменьшается количество энтерококков и стафилококков, изначально превышавших норму.
 
Перспективные приложения метода МСММ
Метод является мощным инструментом в научных исследованиях микробной этиологии любых процессов в организме человека в норме и патологии.
В то же время он готов к рутинному использованию в клинической лаборатории для проведения массовых анализов. Он не дороже и не намного сложнее современных диагностических инструментов. Например – биохимических анализаторов. Наверное, проще компьютерного томографа, который основан на эффекте ядерного магнитного резонанса. Не так давно ЯМР был сугубо научным методом исследования структуры органических веществ, а сейчас рутинно работает в большинстве крупных медицинских центров.
Эффективное использование метода МСММ в клинической диагностике возможно в следующих отделениях и для следующих групп больных:

 
Обоснование экономической эффективности метода ГХ-МС микробныхмаркеров
Стоимость оборудования. Наиболее подходящие приборы стоят около  90 тыс $ США
Стоимость сервисного обслуживания колеблется от 5000 до 500$ в год, в зависимости от того, обслуживает ли технику фирма производитель, другая группа специалистов, или пользователь, если имеет грамотного инженера в штате.
Расходуемые материалы и реактивы – в основном общего назначения – посуда, химреактивы, лабораторный инструмент. Специальные – хроматографические сменные колонки – 1000$ в год, специальные реактивы и расходуемые материалы – 400$  в год.
Новый прибор имеет реальный ресурс в среднем 10 лет. То есть, распределенная стоимость составляет примерно 10-15  тыс $  в год в зависимости от уровня сервисного обслуживания.
Для сравнения: стоимость бактериального анализатора по культурально- биохимическому методу составляет 60-140 тыс $ с ресурсом 5 лет и ежегодными ассигнованиями  на расходуемые материалы 50 тыс $ (питательные среды, тестовые флаконы, плашки, транспортные среды и прочее в скромном варианте). В расчете на год – 60 тыс $ по минимуму. Это согласуется с пятикратной разницей в стоимости определения одного микроба в сравнении с методом МСММ.
 
 
Литература
 
 

1. Белобородова Н.В., Осипов Г.А.. «Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с организмом хозяина». //Вестник Российской академии медицинских наук.-1999.-№7.-С.25-31.
2. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых», КМК Scientific Press, Москва 2003, с. 88-98
3. Дьяченко И.А, Осипов Г.А., Архипова А, Захарова Л, Мурашев А.Н. Изучение влияния ампициллина на микробиоту кишечника у крыс методом газовой хроматографии – масс спектрометрии по маркерным веществам в крови. Третья международная конференция из серии «Наука и бизнеc» 19 — 21 июня 2006 г., Пущино. http://www.rusbio.biz/ru/nb2006_06.shtm
4. Клиническое значение метода хромато-масс-спектрометрии при дерматитах. Учебно-методическое пособие для системы последипломного образования врачей. Утверждено ЦКМС с ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Москва 2011. 60с.
5. Осипов Г.А, Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Количественный in situ микробиологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии – масс спектрометрии. Здравоохранение и медицинские технологии № 5 2007 стр. 20-23.
6. Осипов Г.А., Белобородова Н.В. Патент на изобретение № 2146368 «Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма», Патент зарегистрирован в Госреестре изобретений РФ 10.03 2000 г.- Бюл.№7
7. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В., Ручкина И.Н., Курчавов В.А., Бойко Н.Б., Рогатина Е.Л. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально-биохимическим и хромато-масс-спектрометрическим методами. Эксп. Клин. Гастроэнтерология, 2003; (4): 59-67.
8. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Ручкина И.Н. Висмута трикалия дицитрат в лечении больных постинфекционным синдромом раздраженного кишечника. Русский медицинский журнал      http://www.rmj.ru/articles_5556.htm
9. Осипов, Г.А. Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорганизмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. / Химический анализ в медицинской диагностике.- М.: Наука, 2010.- С.293-368.
10. Парфенов А.И., И.Н.Ручкина, Г.А.Осипов. Коррекция микрофлоры кишечника пробиотиками у больных антибиотико-ассоциированной диареей. Consilium Medicum, Справочник поликлинического врача. Том 04/N2/2006 http://www.consilium-medicum.com/magazines/polik/handbook/article/9919
11. Парфенов А.И., Ручкина И.Н. Активатор местного иммунитета Гепон в комплексной терапии дисбиотических нарушений кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2003. № 3. С. 66-69
12. Поздеев О.К. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001, стр. 123.
13. Федосова Н.Ф., Лядов К.В., Осипов Г.А Новые подходы к анализу инфекционных послеоперационных и посттравматических осложнений, Инфекции в хирургии, Том 8, 2010 г., №2- С.56-62
14. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. В 3-х томах. Том 1.; Микрофлора человека и животных и ее функции. Стр 14-17. М., Грант, 1998.
15. Goodacre R. Metabolomics of a Superorganism. The Journal of Nutrition. International Research Conference on Food, Nutrition, and Cancer held in Washington, DC, July 13–14, 2006.
16. Kinross, J.M. von Roon, A.C., Holmes, E., Darzi, A., Nicholson, J.K. The human gut microbiom: implication for future health care. Current Gastroenterology Reports 2008, 10: 396-403
17. Nicholson J.K., Holmes E., Wilson I.D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat Rev Microbiol. 2005; 3:431–438.
18. Osipov G.A. and Verkhovtseva N.V. Study of human microecology by mass spectrometry of microbial markers. Beneficial microbes. 2011. Accepted for printing