Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов*, А.А. Гонтова,

Г.А. Осипов, Н.И. Сарматова

Сибирский федеральный университет, Россия 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 1

Received 16.11.2009, received in revised form 7.12.2009, accepted 15.12.2009
Показана возможность использования метода хромато-масс-спектрометрии для оценки микроэкологического статуса организма человека по масс-спектрометрии микробных маркеров, в качестве которых выступают жирные кислоты, стерины, альдегиды. По анализу жирных кислот методом ХМС можно количественно определять наличие 57 микроорганизмов в ротовой полости человека.

Ключевые слова: микроэкологический статус, метод определения микроэкологического статуса, ГХ-МС-метод.
 
 
Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы определения микроэкологического статуса организма человека, а также диагностики инфекций имеют определенные ограничения и не- достатки. Например, существенным недо- статком классического бактериологическо- го исследования, помимо дороговизны и длительности (7-10 дней), является невоз- можность оценить роль некультивируемых микроорганизмов, прежде всего анаэробов в инфекционно-воспалительном процессе. Используемый в качестве дополнительного к классическому иммуно-серологический ме- тод непрямой, поскольку выявляет не возбу- дителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации.
Известные молекулярно-биологические ме- тоды, при несомненных преимуществах — прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, уни- версальность, скорость, возможность диа- гностики хронических и латентных инфек- ций, – имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные резуль- таты и невозможность адекватной количе- ственной оценки [1].
Из всего вышесказанного вытекает оче- видная востребованность в надежном коли- чественном экспресс-методе диагностики дисбактериозов и определения возбудите- лей инфекции. Такими свойствами облада- ет метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), основанный на количе-
 
 
* Corresponding author E-mail address: AEfremov@sfu-kras.ru
1 © Siberian Federal University. All rights reserved
 
Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов,.. Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма…
 
 
ственном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альде- гидов, спиртов и стеринов) непосредствен- но в клиническом материале [1-3]. В этом принципиальное отличие метода, придаю- щее ему качественно новое свойство – воз- можность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из сотен видов микроорганизмов, которые обитают, напри- мер, в кишечнике. Метод является высоко- чувствительным, быстрым (2,5 ч на пол- ный цикл исследования), универсальным, экономичным и имеет широкий диагно- стический спектр. Внедрение ГХ-МС дает возможность сократить время и стоимость исследования, минуя стадии  повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. Ме- тод позволяет не только определять маркер- ные вещества (жирные кислоты, альдеги- ды, спирты и стерины) в чистых культурах микроорганизмов, выделенных из клиниче- ского материала по известной технологии, но и количественно устанавливать состав микробного сообщества, который кроется за набором маркеров конкретной пробы. Материалом для исследования служат лю- бые биологические жидкости (кровь, слюна, моча, ликвор и т.д.) [2].
К настоящему времени состав жирных кислот большинства микроорганизмов изу- чен, показана его воспроизводимость, дока- зана их родо- и видоспецифичность. Метод детектирования микроорганизмов по ЖК- маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности ну- клеотидов 16sРНК и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего
синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Другими словами, профиль ЖК так же консервативен, как и строение ДНК. Иссле- дования в области бактериальной палеонто- логии подтвердили постоянство состава ЖК отдельных микроорганизмов и пула их жир- ных кислот, в целом, с глубины времен в 2,5 млрд лет.
В данной работе мы продемонстрируем возможности метода ХМС для оценки ми- кроэкологического статуса и диагностики ин- фекций организма человека на примере мазка ротовой полости человека.
Известно, что бактериям свойственно большое разнообразие ЖК и жирных альде- гидов. В настоящее время их насчитывают более двухсот пятидесяти. В организме че- ловека их всего около двадцати пяти. Это обстоятельство определяет возможность родового или видового анализа инфекций и дисбиозов на преобладающем фоне биологи- ческой жидкости непосредственно в клиниче- ском материале.
Наиболее часто встречающиеся в кли- нических пробах ЖК альдегиды и стерины перечислены в табл. 1 с отнесением к вероят- ным таксонам микроорганизмов [1-2].
Аналогичные зависимости обнаружены для гидроксикислот, спиртов, альдегидов и стеринов [1, 2, 4, 5].
Метод МСММ был применен нами для оценки микроэкологического статуса че- ловека по количественному определению индивидуальных микробных сообществ ротовой полости практически  здоровых лиц юношеского возраста обоего пола. По- лученные в ходе исследования результаты сравнивались с аналогичными показате- лями баз данных, включающих сведения о составе жирных кислот штаммов бактерий, вирусов и микроскопических грибов [6, 7]. Материалом для  исследования служили
 
Таблица 1. Высшие жирные кислоты в составе клеточной стенки с отнесением к микроорганизмам, у которых они наиболее часто встречаются*

* Вещества приведены в порядке возрастания числа атомов углерода в цепи молекулы, что соответствует хроматографическому времени удерживания
** Обозначения веществ: 17:1 — 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия — число двойных связей; а,i — в начале означает разветвление.
 
 
 
мазки со слизистой зева, взятые у 19 кли- нически здоровых людей в возрасте 18-20 лет. Материал собирали стерильным ват- ным тампоном, помещали в транспортную угольную среду Эймса и доставляли в лабо- раторию не позднее 24 ч. При подготовке к хромато-масс-спектрометрическому анали- зу пробу на ватном тампоне высушивают c добавлением равного по объему количества метанола и подвергают кислому метанолизу в 1М HCl в метаноле. Метанолиз проводят в 0,4 мл реактива на 10 –15 мг сухого остат- ка в течение 1 ч при 80 °С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроор- ганизмов и других клеток жидкости в виде
метиловых эфиров и диметилацеталей. Эти компоненты экстрагируют гексаном (400 мкл) в течение 5 мин, гексановый экстракт высушивают, а сухой остаток обрабаты- вают 20 мкл  N,О-бис(триметил-силил)- трифторацетамида в течение 15 мин при
80 °С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот и стеролов. К реакци- онной смеси эфиров добавляют 80 мкл гек- сана, и 1-2 мкл раствора вводят в инжектор ГХ-МС системы.
Хроматограмма жирных кислот и других продуктов жизнедеятельности микробных со- обществ приведена на рисунке, а ее обработка в пересчете на индивидуальные микробы – в табл. 2.

Рис. Типичная хроматограмма жирных кислот мазка ротовой полости здорового человека по выделенным ионам
 
 
 
По результатам проведенной серии ана- лизов установлено, что нормальная микро- флора ротовой полости здоровых молодых людей возраста 18-20 лет, проживающих в Красноярске, выглядит следующим образом: преобладают такие группы микроорганизмов, как Streptococcus, Mycobacterium/Candida, Actinomyces viscosus, микроскопические гри- бы, ситостерол.
По литературным данным общая обсе- мененность микробных сообществ должна составлять 6168 кл/г*105. А по результатам полученных экспериментов практически у  16 пациентов значение общей обсемененно- сти превышает эту величину в 2 раза, варьи- рует от 6807 до 16233 кл/г*105.
Интересно отметить, что после курса масляных ингаляций 3 %-м пихтовым мас- лом картина миклофлоры через 2 ч воздей- ствия изменилась, отмечено существенное подавление роста Streptococcus, Clostridium ramosum, Lactobacillus, Clostridium perfringens, Nocardia asteroides, цитоме- галовируса, микра грибов, ситостерола, Actinomycetes 10Me14. Неизменным осталось количество Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium/Str.  Pneumonia, Cl.difficile, Prevotella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus mutans, Herpes, E.lentum 7741 (группа В), Actinomyces viscosus.
Из полученных результатов можно сде- лать вывод, что эфирное масло нормализует
Таблица 2. Результаты исследования микробных маркеров в мазке зева методом хромато-масс- спектрометрии, проба до и после обработки эфирным маслом

микрофлору ротовой полости, в отличие от антибиотиков не угнетает общий рост микро- флоры, действует более мягко, не раздражая слизистую [8, 9].
Проведенная оценка микрофлоры зева здоровых лиц юношеского возраста показа- ла широкий диапазон аэробных и анаэроб- ных микроорганизмов, общее количество которых превышает норму, принятую для здоровых людей средней полосы России. Следовательно, метод газовой хромато- графии – масс-спектрометрии позволяет
изучить видовой состав микроорганизмов, населяющих микробиоценозы человека раз- личных биосубстратов. Полученные резуль- таты исследования состава микробных мар- керов в мазке зева практически здоровых лиц юношеского возраста дадут возмож- ность использовать эти данные в качестве контрольных значений в дальнейших иссле- дованиях, а также решать вопросы профи- лактики, выявляя носительство патогенной микрофлоры и формируя группы риска по развитию определенных заболеваний.
 
 
Работа выполнена при финансовой поддержке НИР № 1.3.09, проводимой по заданию Фе- дерального агентства по образованию.
 
Список литературы

1. Минорные жирные кислоты биологических жидкостей урогенитальных органов и их значимость в диагностике воспалительных процессов / Крымцева Т.А., Осипов Г.А., Бойко Н.Б., Соколов Я.А., Демина А.М., Радюшина Т.В., Осипов Д.Г. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 2. С.92-101.
2. Осипов Г.А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В., Ручкина И.Н. и др. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культурально– биохимическим и хромато–масс–спектрометрическим методами //Эксперим. и клинич. гастроэнтерология. 2003. №4. С.59–62.
3. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М.: Химия, 256с.
4. ОсиповГ.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов

// Патент РФ № 2086642. С12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4. Приоритет от 24 дек.1993 г.

5. Осипов Г.А., Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах // Вестник РАМН. Т.13.

№2. С. 52-59.

6. Воробьев А.А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебник. М., 224с.
7. Koroch A.R., Juliana H.R. Bioactivity of essential oils and their components // Flavours and Fragrances. 2005.
8. Стецюк О.У. Зависимость фармокодинамических параметров антибиотиков от условий определения чувствительности бактериальных возбудителей внебольничных и госпитальных инфекций: дисс. … канд. биол. наук. Смоленск,
9. Хуснутдинова Л.М. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в  норме при патологии // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.

№1. С.60-63.
– 357 –
 
 

Definition of the Microecological Status and Diagnosis of the Human’s Infections, using the Method

of Chromatography-Mass Spectrometry
 

Elens G. Strukova, Alexandr A. Efremov, Anna A. Gontova, Georgiy A. Osipov and Natalia I. Sarmatova

Siberian Federal University, 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041 Russia

It was shown the possibility of using the method of chromatography-mass spectrometry to estimate microecological status of the human by the method of mass spectrometry microbial markers, which are mainly fatty acids, sterols, aldehydes. For analysis of fatty acids by CMS it is possible quantify the presence of 57 microorganisms in the human oral cavity.
Keywords: microecological status, method of mass spectrometry microbial markers,  GC-MS-  method.