Быстрова О.В., Осипов Г.А.
Международный аналитический центр ООО «Интерлаб», Москва
 
Резюме. Систематическое изучение микробного сообщества женских половых органов методом масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) позволило сформировать представления о нормальной микрофлоре и обозна- чить признаки протекающих инфекционных процессов. Исследуя пробы из раз- ных отделов женской репродуктивной системы, мы можем охарактеризовать отличительные компоненты естественной микробиоты, а также выявить типичные закономерности патогенеза отдельных органов. Преимущества метода МСММ позволяют корректировать представления о моноэтиологич- ности инфекции, показывают ее полимикробность. Метод дает возможность определить микроорганизмы, скрытые при традиционном подходе, и демон- стрирует возможность участия компонентов естественной микробиоты в инфекционном процессе. Данные, получаемые методом МСММ, имеют особое значение в случаях ранней диагностики, когда грамотно назначенная целевая антибактериальная терапия позволяет избежать оперативного вмешатель- ства.
Ключевые слова: Метод масс-спектрометрии микробных маркеров, МСММ, микроорганизмы, инфекция, анаэробы, жирные кислоты, внутрен- ние половые органы. Method of mass-spectrometry of microbial markers, MSMM, microorganism, infection, anaerobes, fatty acids, internal sex organs.
 
Цель. Нарушение гомеостатичного естественного микробного сообще- ство слизистых половых органов может угрожать как здоровью женщины, так и главной физиологической функции женских половых органов – репродук- тивной. Целью настоящего исследования является изучение природы инфек- ционных процессов женских половых органов: изучение влияния условно-па- тогенной флоры, оценка вклада анаэробов и других, трудно культивируемых микроорганизмов, выявление вклада компонентов нормальной микрофлоры в патогенные процессы наряду с традиционными объектами клинической микро- биологии.
Материалы и методы. Состав микробного сообщества в клинических образцах исследовался методом масс-спектрометрии микробных маркеров
 
 
(МСММ). Метод «Оценки микроэкологического статуса человека методом хромато-масс-спектрометрии» имеет разрешение к применению на террито- рии Российской Федерации в качестве медицинской технологии (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).
Пробы (биоптаты тканей, отделяемое органов) подвергали кислому ме- танолизу (400 мкл 1М HCl/MeOH, 80ºC, 45 мин) для высвобождения маркер- ных веществ (высших жирных кислот, жирных альдегидов, стеринов) с после- дующей их экстракцией гексаном (1 х 400 мкл). Экстракты высушивали, сухой остаток  дериватизировали   N,О-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом (20 мкл, 80ºC, 5 мин). Реакционные смеси разбавляли 60 мкл гексана и в таком виде анализировались методом газовой хроматографии с последующим масс- спектрометрическим детектированием (ГХ-МС). Для ГХ-МС анализа исполь- зовался Микробиологический анализатор Маэстро (Интерлаб, Россия). Режим анализа программируемый: температурный градиент 135 – 320ºC, скорость подъема 7 ºC/мин, разделение на колонке с фазой 5% фенил-метилполисилоксан (30м х 0,25мм х 0,25мкм), ионизация электронным ударом 70эВ, детектирова- ние в режиме селективных ионов. Количественная оценка проводилась по вну- треннему стандарту – дейтерометиловый эфир тридекановой кислоты (300 нг). Расчет проводился по описанному ранее алгоритму [1]. Достоверность резуль- татов маркерного анализа подтверждалась сравнением состава микроорганиз- мов в норме и при патологии, проведением корреляций с клинической картиной заболевания, изменениями концентраций маркеров патогенов в результате ле- чения антибиотиками, а также сравнением с литературными данными.
Результаты и обсуждение. Метод МСММ основан на количественном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альде- гидов, спиртов и стеринов). В отличие от классического бактериологическо- го исследования, методом МСММ возможно не только определять маркерные вещества в чистых культурах микроорганизмов, выделенных из клинического материала по известной технологии, но и работать непосредственно с клини- ческими пробами (без предварительного культивирования микроорганизмов и использования биохимических тестовых материалов и генетических прайме- ров). Уникальная особенность методологического подхода, позволяет опреде- лять минорные компоненты специфичных микробных маркеров, отделяя их от подавляющего фона матрицы биологических проб, а применяемый алгоритм расчета дает возможность количественно определять состав микробного со- общества, который кроется за набором маркеров конкретной пробы.
Результаты систематического изучения микроэкологии женских половых органов свидетельствуют о гомеостазе маркеров микроорганизмов в норме [2, 4]. В микробиоценозе вагины обнаруживаемое методом МСММ суммарное количество анаэробов (109 клеток/мл) на порядок выше, чем количество аэробов (108 клеток/ мл). Состав микробиоты и соотношение компонентов представлены на рисунке 1.
В вагинальной жидкости в норме в количестве ~ 4,3 x 108 клеток/мл присутству- ют лактобациллы (палочки Дедерлейна), молекулярными свидетелями которой являются циклононадекановая (лактобацилловая) кислота. Маркером эубактерий, находящихся на втором месте по доле в микробном сообществе (~ 3,5 x 108 кле- ток/мл)  является  октадеценовый  альдегид  и  дегидрохолестерол (копростанол)
– продукт интерактивного метаболизма Eubacterium и клеток организма-хозяи- на [6]. Высоко содержание в норме и пропионобактерий (~ 3,1 x 108 клеток/мл). Они не являются клеточными компонентами самих клостридий, и образуются в результате воздействия бактериальных ферментов на клетки тканей организма- хозяина [7]. Следующими по количественному вкладу в микробное сообщество оказываются микроскопические грибы Candida albicans, которые обнаруживает- ся в вагинальных жидкостях  пациенток без проявления  патологий  в количестве
~ 1,2 x 108 клеток/мл. Молекулярным маркером для определения кандиды явля- ется 9-гептадеценовая кислота. В таком же количестве  (~ 1,1 x 108 клеток/мл) во влагалище присутствуют актиномицеты Actinomyces viscosus. Клостридии Clostridium  perfringens  в вагинальном  содержимом  присутствуют  в количестве
~ 3,3 x 106 клеток/мл. Маркеры, используемые для определения C. perfringens: 10-гидроксистеариновая и 10-гидроксиоктадеценовая кислота [3]. Суммарно, пе- речисленные выше микроорганизмы представляют собой 70% от общей микроб- ной нагрузки. Оставшаяся часть на 60% представлена анаэробами. В зависимости от степени чистоты влагалища в микрофлоре могут присутствовать гнилостные бактерии родов Bacillus, Proteus, Clostridium, Spirochaeta.

Рис.1.

Состав микробиоты влагалища в отсутствие патологий
Таблица 1.
Смешанная инфекции в образце вагинальной жидкости с обозначением доминант

 
 
По литературным данным при инфекционных процессах в половых орга- нах доля полимикробной инфекции составляет примерно 20-30% [2]. По нашим данным инфекции всегда полимикробны. В таких случаях клинические про- явления заболевания нетипичны и определяются характером взаимодействия между различными возбудителями, приводящим к угнетению или стимуляции одного вида микроорганизма другим. При этом в инфицированном материале обнаруживается участие до двенадцати таксонов микроорганизмов. Сравни- тельный анализ состава микробиоты выявил ряд закономерностей в изменении состава микробного сообщества при патогенных процессах, проходящих в раз- ных отделах репродуктивной системы.
В таблице 1 и соответствующей диаграмме представлен пример смешан- ной инфекции с обозначением доминант в образце вагинальной жидкости.
При вагинитах основная роль в инфекционном процессе отводится бак- терии C. perfringens. В отсутствие в слизистых влагалища Candida albicans и при содержании С. perfringens на уровне 108 клеток/мл (что соответствует 30-кратному превышению по сравнению с нормой) наблюдается ложный кан- дидоз, сопровождающийся также повышением содержания микробов рода Propionibavterium и Staphylococcus epidermis. Для пациенток с хламидиозом характерно появление 3-гидрокси-изо-эйкозановой, 3-гидрокси-эйкозановой, 3-гидрокси-докозановой кислот, содержащихся в клетках Chlamydia trachomatis. При гонорее в образцах детектируется 3-гидроксидодекановая кислота – компо- нента клеток Neisseria, а также маркеры сопутствующей анаэробной микрофло- ры (пептострептококк, бактероиды, фузобактерии, превотелла, Selenomonas). В процессах, связанных с хроническими воспалениями участвуют микроорганиз- мы рода Pseudonocardia, Fusobacterium/Haemophylus, Klebsiella, Streptococcus, а также Staphylococcus epidermidis и C. perfringens.
Особенностью инфицирования внутренних половых органов является участие в колонизация микроорганизмов, характерных для кишечной флоры: Eubacterium spp. (E. moniliforme, E. nodatum, E. sabureum), Propionibacterium freudenreichii, Bifidobacterium spp. Серия анализов одной и той же больной пока- зывает более чем десятикратное увеличение численности вида P. freudenreichii, родов Eubacterium и Bifidobacterium в матке и придатках по сравнению с уров- нем колонизации влагалища в норме. В целом уровень колонизации в маточных трубах и ткани яичников бифидобактериями, эубактериями и пропионобакте- риями достигает 3-6×109 клеток/мл, в отличие от эндометрия и ткани матки, где их содержание близко к нормальному. Также характерно присутствие ана- эробных актиномицетов Actinomyces viscosus (до 6×108 клеток/мл) и в отдель- ных случаях анаэробных стрептококков Streptococcus mutans (108 клеток/мл). Клостридии также участвуют в инфицировании внутренних половых органов, но здесь основная роль отводится не C. perfringens, а C. ramosum. Наиболее характерные общие закономерности из описанных выше обобщены на рисунке 2.

Рис.2.

Особенности изменения содержания микроорганизмов
при инфекционных процессах в разных отделах половой системы в сравнении с их содержанием в норме в отделяемом влагалища
 
Участие в инфекционных процессах микрофлоры, типичной для кишеч- ника (лактобациллами и бифидобактериями) может иметь двоякую интерпрета- цию. С одной стороны, существует мнение о транслокации этих микроорганиз- мов в очаг воспаления с целью образования в поврежденном органе биопленки, подобной кишечной, которая стимулирует местный иммунитет, защищает от местных патогенов и способствует восстановлению поврежденной ткани. С другой стороны, обнаруживаемый высокий уровень слизеобразующих кишеч- ных бактерий при инфекциях может приводить к негативным изменениям в ма- точных трубах и ткани яичников за счет физического перекрывания мембран и капилляров мукозной биомассой.
У женщин с проблемами беременности или неудачами ЭКО выяв- ляется увеличение численности в вагинальном содержимом C. perfringens, Helicobacter pylori, актинобактерий родов Streptomyces и Nocardia. При невына- шивании беременности C. perfringens, H. pylori, одна или несколько актинобак- терий (Streptomyces, Pseudonocardia, Actinomyces viscosus, Nocardia asteroids и Rodococcus) обязательно выступают агентами инфекции в эндометрии и цер-
 
 
викальном канале. Микроорганизмы этой группы демонстрируют цитологиче- скую активность, что выдвигает их на первый порядок в списке потенциальных агентов патологических процессов.
Наши наблюдения подтверждают результаты, полученные ранее: пода- вляющее большинство воспалительных заболеваний обусловлено собственной условно-патогенной микрофлорой, ведущая роль в развитии которых принад- лежит наиболее вирулентным анаэробам, энтеробактериям и коккам [5]. Таким образом, метод позволяет измерить вклад всех компонентов микрофлоры в воспалительный процесс и определить истинного возбудителя заболевания, а также продемонстрировать, что инфекция носит полимикробный характер при доминировании анаэробов. Выявляемые агенты хронически протекающей, не обнаруживаемой при традиционных подходах, инфекции помогают предполо- жить причины проблем бесплодия и невынашивания беременности.
Выводы. Систематическое исследование микробного сообщества вну- тренних половых органов женщин с помощью метода масс-спектрометрии микробных маркеров подтверждает современные представления о гомеостазе маркеров микроорганизмов в норме и позволяет выявить специфику воспа- лительных процессов. Рассмотрение микробиоты в целом и количественная оценка вклада каждого ее компонента позволяет пересмотреть классическое представление об инфекции, как результате размножения чужеродного микро- организма, и выявить состояния, где инфекция носит эндогенный характер и является следствием чрезмерного размножения естественных компонентов ми- крофлоры. Понимание природы патологических процессов позволяет грамотно назначать терапию.
 

Литература:

1. Годков М.А., Осипов Г.А., Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Возможности масс-спектрометрии микробных маркеров в лабораторном мониторинге дис- биозов и инфекций. Справочник заведующего КДЛ. 2011, № 7, С.35-44.
2. Крымцева Т.А., Осипов Г.А., Бойко Н.Б., Соколов Я.А., Демина А.М., Радюшина Т.В., Осипов Д.Г.. Минорные жирные кислоты биологических жид- костей урогенитальных органов и их значимость в диагностике воспалитель- ных процессов. Журн. Микроб. Эпидем. Иммун. 2003, № 2:92-101.
3. ОсиповГ.А, Федосова Н.Ф., Лядов К.В. Количественный in situ микро- биологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии – масс спектрометрии. Здраво- охранение и медицинские технологии. 2007, № 5: 20-23.
4. ОсиповГ.А. Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорганиз- мов и их сообщества в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах. Хими- ческий анализ в медицинской диагностике.- М.: Наука, 2010 С.293-368.

5. Сидорова И.С., Макаров И.О., Шешукова Н.А. Воспалительные заболе- ваниявнутренних половых органов. Практическая медицина. Москва.  С.79.
6. Mott G.E., Brinkley W. Plasmonylethanolamin: growth factor for cholesterol-reducing Eubacte-rium. J.Bacteriol. 1979,139(3):755-760.
7. Koichi On the production of hydroxy fatty acids and fatty acids oligomers in the course of adi-pocere formation. Nippon Hoigaku Zasshi. 1984, 38(3):257-272.

КОНЦЕПЦИЯ АНАЛИЗА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО РИСКА В ФАРМАЦИИ

 
Габидова А.Э.1, Кочаровец В.И.2, Галынкин В.А.3, Тихонович И.А.4 1Российский научно-исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова,
2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова,
Москва,
3Санкт-Петербургский государственный технологический институт, ООО «РОСБИО»,
4 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург
Современный мир вступил в стадию системного кризиса{ 1,2}. На про- тяжении 10 тыс. лет всей истории цивилизации раз в несколько сот лет про- исходит совпадение трех уровней кризисов: кризиса глобальной цивилизации, кризисов мировых и локальных цивилизаций. Происходит переход к постинду- стриальной цивилизации и формированию пятого поколения локальных циви- лизаций. В ведущих странах мира пятый технологический уклад уходит в исто- рию. Развитый мир переходит в шестой технологический уклад. Россия в плане технологическом находится, в основном, в первых поколениях пятого уклада. Мир движется в сторону инновационных наукоемких продуктов. Доля России на высокотехнологическом рынке мира сегодня составляет всего лишь 0,3%. Для того чтобы Россия вошла в технологический мир ХХ1 в. нужна страте- гия инновационного развития . Руководством России политически определена стратегия инновационного развития{3}. В центре планируемых изменений че- ловек, качество жизни человека. Но человек не исключительно потребляющий, а человек духовный – формирование нового человека, определяющий элемент формирующей стратегии.